РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2011, том 5(14), № 2, с. 129-134
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛ TLR9-ОПОСРЕДОВАННОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ ЦЕРВИКАЛЬНОГО КАНАЛА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 2 ТИПА IN VITRO
© 2011 г. О.Ю. Сомова, О.А. Ганковская, В.Ф. Лавров, Л.В. Ганковская*, В.В. Зверев
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, Россия;
*ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, Москва, Россия
Поступила: 30.11.2010. Принята: 22.04.2011
Вирус простого герпеса 2 типа (ВПГ-2) является одним из наиболее распространенных вирусных патогенов человека, передающихся половым путем. Toll-подобный рецептор 9, экспрессируемый клетками слизистой урогенитального тракта, способен распознавать не-метилированные повторы CpG ДНК ВПГ-2. Целью исследования было определить динамику экспрессии генов TLR9, транскрипционного фактора NF-kB и TNFa в эпителиальных клетках цервикального канала под действием ВПГ-2. В ходе экспериментов культуру клеток HeLa заражали ВПГ-2 и через 1, 3, 6, 12 и 24 ч после инфицирования определяли уровни экспрессии исследуемых генов с помощью ПЦР в режиме реального времени и измеряли количество TNFa в супернатанте методом ИФА. Было установлено, что под действием ВПГ-2 в клетках HeLa значительно увеличивалась экспрессия генов TLR9, NF-kB и TNFa с первых часов после инфицирования, максимальные значения экспрессии гена TLR9 и NF-kB наблюдались через 3 ч, гена TNFa — через 6 ч после заражения клеток. Через 24 часа после заражения клеток экспрессия гена NF-kB повторно возрастала. Полученные результаты свидетельствуют об активации экспрессии генов TLR9, NF-kB и TNFa и быстром развитии реакций врожденного иммунитета в эпителиальных клетках цервикального канала под действием ВПГ-2.
Ключевые слова: врожденный иммунитет, Toll-подобный рецептор 9, TNFa, ядерный фактор kappa B, вирус простого герпеса типа 2
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время по своей распространенности герпетическая инфекция, вызываемая вирусом простого герпеса 2 типа (ВПГ-2), занимает среди вирусных инфекций, передающихся половым путем, второе место после папилломавирусной инфекции [1]. ВПГ-2 вызывает поражение урогенитального тракта (генитальный герпес), а при первичном заражении или активации латентной инфекции во время беременности может служить причиной тяжелых осложнений (невынашивания, неонатального герпеса новорожденных, мертворождаемости и др.) [1, 2]. На первом
Адрес: 115088, Москва, 1-ая Дубровская ул., д. 15. Отдел вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе, лаборатория диагностики вирусных инфекций. E-mail: oksgan@yandex.ru, oxanass@mail.ru
этапе развития герпетической инфекции вирус размножается в районе «входных ворот» инфекции, гематогенно диссеминирует и затем неврогенным путем поступает в симпатические региональные нервные ганглии (чаще крестцового и поясничного нервов), где становится недоступным для факторов иммунной защиты [1, 3].
«Входными воротами» для ВПГ-2 являются слизистые урогенитального тракта. Факторы врожденного иммунитета служат первой линией защиты, препятствующей проникновению и распространению инфекционных агентов [4, 5, 6]. Клетки слизистой урогенитального тракта экспрессируют поверхностные и внутриклеточные рецепторы врожденного иммунитета — ТЬИз, которые распознают уникальные высококонсервативные структуры микроорганизмов и некоторые эндогенные молекулы организма [7—10]. При герпес-
вирусной инфекции особое значение имеет TLR9 [11] — эндосомальный рецептор, распознающий неметилированные повторы CpG ДНК бактерий и вирусов, включая ВПГ-2 [12, 13]. Взаимодействие лиганда с TLR9 вызывает активацию транскрипционного фактора NF-kB, который транслоцируется в ядро и запускает процесс транскрипции генов, кодирующих синтез ряда провоспалительных ци-токинов, таких как IL-1, IL-6, IL-8, TNFa и др., а также хемокинов, молекул адгезии, проти-вомикробных пептидов и т.д. [14—17]. Таким образом, NF-kB регулирует экспрессию целого ряда генов, белковые продукты которых играют значительную роль в реакциях врожденного иммунитета.
Активно исследуемые в последние годы механизмы взаимодействия TLRs с ВПГ-2, были связаны, главным образом, с системой рецепторов, экспрессируемых дендритными клетками, макрофагами и другими клетками [18 — 20]. В то же время механизмы активации TLRs и их сигнальных путей под действием ВПГ-2 в клетках слизистой урогенитального тракта, первыми отвечающими врожденными иммунными реакциями на инфицирование ВПГ-2, остаются практически не известными.
В связи с этим целью настоящего исследования стали определение уровней экспрессии генов TLR9, NF-kB и TNFa при моделировании ВПГ-2-инфекции, а также проведение сравнительного анализа экспрессии гена TNFa и продукции данного цитокина эпителиальными клетками цервикального канала in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клеточные культуры и вирусы
В модели in vitro использовали ВПГ-2 штамм MS (Национальная коллекция вирусов, Великобритания) и клеточную культуру HeLa, которая является эпителиальными клетками аденокарциномы цервикального канала (была предоставлена ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии Н.Ф. Гамалеи). Клетки HeLa культивировали в DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Flow Laboratories, Великобритания).
Схема эксперимента
Для проведения экспериментов клетки HeLa пересевали в 24-луночные планшеты и культивировали в 1 мл DMEM в течение 48 часов при температуре 37 °С. Конечная
концентрация клеток в лунках составляла (6±0,8) • 105 кл/мл. К культуре клеток HeLa добавляли вируссодержащую жидкость (дозы ВПГ-2 составляли 2,5 и 3,5 ТЦД50/0,1 мл). Через 1, 3, 6, 12, 24 ч после инфицирования куль-туральную жидкость собирали для дальнейшего определения содержания в ней TNFa с помощью метода ИФА. Через указанные промежутки времени из клеток выделяли РНК для проведения реакций обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени. Эксперимент был повторен 3 раза.
Выделение РНК
РНК из клеток выделяли методом сорбции на силикагеле, используя набор «Рибо-сорб» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Ампли-Сенс, Россия), согласно инструкции производителя.
Реакция обратной транскрипции
В ходе реакции обратной транскрипции на матрице выделенной РНК синтезировали кДНК исследуемых генов. К 2 мкл выделенной РНК добавляли 1 мкл Random праймеров и 3 мкл в концентрации 1 ОЕ/мл обратных праймеров для TLR9, NF-kB и TNFa. Полученную смесь нагревали до 75 °С и инкубировали в течение 3 мин. После отжига праймеров пробирки охлаждали. На следующем этапе в реакционную смесь добавляли 2 мкл 2,5 мМ dNTP (Сибэнзим, Россия), 3 мкл 10-кратного буфера Reverse Transcriptase Bufer (Сибэнзим, Россия) и 0,05 мкл фермента M-Mult Reverse Transcriptase (Сибэнзим, Россия). Полученную реакционную смесь (конечный объем составлял 30 мкл) инкубировали 1 ч при 37 °С и 10 мин при 95 °С. Праймеры для последовательностей TLR9, NF-kB, TNFa были подобраны с помощью программы Vector NTI 8.0 и синтезированы фирмой Синтол (Россия). Полученные образцы кДНК хранили при -70 °С.
ПЦР в режиме реального времени
Для определения количества копий кДНК проводили полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени. За основу ПЦР-смеси брали «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркали-рующего красителя SYBR Green I» (Синтол, Россия). Реакционную смесь готовили согласно инструкциям производителя. Исполь-
зуемые в ПЦР TaqMan зонды были сконструированы с помощью программы Vector NTI 8.0 и синтезированы фирмой Синтол (Россия). Температура отжига праймеров и зондов составляла для TLR9 и NF-kB — 64 °С, а для TNFa — 60 °С. ПЦР в режиме реального времени проводили на приборах АНК-16 и АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН, Россия). Результаты реакции рассчитывали с помощью программного обеспечения амплификаторов. Подсчет копий кДНК исследуемого гена проводили относительно 106 копий гена р-актина. Количество копий гена р-актина определяли в ходе ПЦР в режиме реального времени с использованием «Набора реактивов для обнаружения и определения кДНК р-актина человека» (Синтол, Россия). ПЦР-системы для количественного определения кДНК TLR9, NF-kB и TNFa были отработаны ранее [21].
Иммуноферментный анализ
Содержание TNFa в культуральной жидкости через указанные промежутки времени после инфицирования определяли с помощью метода ИФА, используя набор Imunnoassay Kit Human TNFa (Invitrogen, США) и фотометр ELx800 (Bio-Tek Instruments, США).
Статистический анализ данных
Статистическая обработка данных проводилась с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни [22]. Для каждой группы полученных результатов рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение от среднего. Результаты представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение от среднего».
РЕЗУЛЬТАТЫ
Экспрессия генов TLR9, NF-kB и TNFa под
действием ВПГ-2 в культуре клеток HeLa
Исследование экспрессии генов проводили как в неинфицированной культуре клеток HeLa, так и в культуре клеток, зараженных ВПГ-2. Относительные значения количества копий мРНК TLR9, NF-kB и TNFa в неинфи-цированных клетках через 1, 3, 6, 12, 24 ч не имели статистически значимых различий, по сравнению с данными показателями в неин-фицированных клетках в нулевой точке эксперимента (0 ч).
Под действием ВПГ-2, начиная с первых часов после инфицирования клеток, уровни экспрессии генов TLR9, NF-kB и TNFa значительно увеличивались (Рис. 1). Максимальные значения экспрессии генов TLR9 и NF-kB наблюдались через 3 ч, а гена TNFa — через 6 ч после инфицирования. Инфицирование ВПГ-2 в дозе 3,5 ТЦД50/0,1 мл повышало экспрессию генов TLR9 и NF-kB (через 3 ч) и TNFa (через 6 ч), соответственно, в 50, 10 и 35 раз, по сравнению с уровнями экспрессии генов в неинфицированных клетках (различия статистически достоверны на уровне значимости a < 0,01). Инфицирование ВПГ-2 в дозе 2,5 ТЦД50/0,1 мл увеличивало соответствующие показатели в 20, 6 и 16 раз, соответственно (a < 0,01).
После достижения максимальных значений в указанные после инфицирования промежутки времени уровни экспрессии генов TLR9, NF-kB и TNFa в инфи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.