= РАДИАЦИОННАЯ ЦИТОГЕНЕТИКА =
УДК [57+61]::539.1.04
ДИНАМИКА ПЕРЕСТРОЙКИ ГЕНОВ Т-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА И ЭМИГРАЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ИЗ ТИМУСА В ПЕРИОД ПОСТРАДИАЦИОННОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ
© 2013 г. А. Д. Донецкова*, Н. И. Шарова, М. Ф. Никонова, А. Н. Митин, М. М. Литвина,
В. В. Комогорова,
Институт иммунологии ФМБА России, Москва
Исследовали восстановление популяции Т-клеток и миграцию Т-лимфоцитов из тимуса во вторичные лимфоидные органы после сублетального воздействия у-излучения, используя в качестве основного методического подхода определение Т-рецепторных эксцизионных колец (ТЯБС), ТКЕС представляют собой кольцевидные эписомные структуры, формирующиеся при перестройке генов Т-клеточного рецептора (ТСЯ). В тимусе динамика TR.EC практически совпадает с динамикой кле-точности органа, в частности с содержанием клеток, перестроивших гены ТСК и экспрессирующих рецепторный комплекс CD3-TCR. ТКЕС можно рассматривать как один из маркеров этих клеток. Во вторичных лимфоидных органах ТКЕС-содержащие клетки образуют фракцию Т-клеток — недавних эмигрантов из тимуса. В лимфатических узлах после значительного падения содержания ТКЕС в ранний срок после облучения (4 сут) регистрируется увеличение их содержания за счет миграции из тимуса в период экстренного восстановления этого органа (пик — 10 сут). Вторичная атрофия тимуса сопровождается ослаблением миграции ТКЕС-содержащих клеток в лимфатические узлы. В селезенке на 4-е сут регистрируется подъем содержания ТКЕС. Весь последующий восстановительный период (до 60 сут) характеризуется низким уровнем ТКЕС, что можно связать с интенсивной гомеостатической пролиферацией, которая приводит к "разбавлению" неделящихся ТКЕС в популяции Т-клеток. Таким образом, определение ТКЕС позволяет получить новую информацию относительно восстановительных и миграционных процессов в лимфоидных органах в период пострадиационной регенерации.
А. А. Ярилин
Т-клетки — недавние эмигранты из тимуса, Т-рецепторные эксцизионные кольца, ионизирующаяради-ация, пострадиационное восстановление.
БОТ: 10.7868/80869803113060039
Основные закономерности лучевого поражения и пострадиационного восстановления лимфоидных органов и популяций лимфоцитов в общих чертах изучены несколько десятилетий назад [1—3]. В последние годы использование технологии проточной цитометрии позволило существенно уточнить и обогатить эти знания [4]. В данной работе мы использовали для анализа по-страдиационого восстановления Т-лимфоцитов новый подход — определение Т-рецепторных эксцизионных колец — TREC (T-receptor excision circles).
Природа TREC такова. Центральным событием Т-лимфопоэза, осуществляемого в тимусе, является формирование зрелого Т-клеточного рецептора (TCR) путем рекомбинации генетических сегментов зародышевой линии. Пространственно разделенные сегменты сближают-
* Адресат для корреспонденции: 115478 Москва, Каширское ш., 24, корп. 2, ГНЦ "Институт иммунологии" ФМБА России; тел.: +7-906-700-66-45; e-mail: almira_donetskova@yahoo.com.
ся, содержащийся между ними генетический материал вырезается, замыкается в кольцо (это и есть ТКЕС) и перемещается в цитоплазму, где формирует эписому [5, 6]. Благодаря наличию в составе ТКЕС консервативных последовательностей ДНК их удается определить с помощью по-лимеразной цепной реакции.
Поскольку ТКЕС содержатся примерно в 70% Т-клеток, созревающих в тимусе [5, 7], подавляющее число эмигрирующих из тимуса Т-лимфоци-тов также содержат их, образуя фракцию недавних эмигрантов из тимуса [8]. При делении клеток эписомальная ДНК, составляющая основу ТКЕС, не реплицируется, что приводит к "разбавлению" этих структур в популяции периферических Т-клеток, т.е. ТКЕС элиминируются из популяции Т-клеток в ходе их пролиферации [5,9].
Из сказанного следует, что оценка содержания ТКЕС в тимусе и периферическом отделе иммунной системы позволяет решать две разные задачи — оценить в первом случае интенсивность
Т-лимфопоэза, во втором — уровень миграции Т-клеток из тимуса во вторичные лимфоидные органы (лимфатические узлы, селезенка и т.д.) [10]. Цель данной работы состояла в изучении названных процессов в динамике пострадиационного восстановления иммунной системы путем определения TREC в тимусе, лимфатических узлах и селезенке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объектом исследования служили мыши-самки линии C57BL/6 (вес 18—20 г), полученные из питомника РАМН "Столбовая". Было проведено два независимых эксперимента, в обоих экспериментах сформированы две группы, одинаковые между собой по возрасту и массе (опытная и контрольная), по 3 животных в каждой группе. Мышей опытной группы подвергали общему воздействию у-излучения 137Cs на установке "Стебель" (Россия) в дозе 4 Гр. Контролем к каждому сроку наблюдения служили мыши, содержащиеся в тех же условиях, что и облученные мыши. Забой животных и исследование лимфоидных органов проводили через 4, 8, 10, 12, 20, 30 и 60 сут после облучения.
Тимус, селезенку и четыре лимфатических узла (два подмышечных и два подколенных) извлекали, освобождали от соединительной ткани, суспензировали в PBS с добавлением 1%-ного BSA и 0.1%-ного NaN3, эритроциты лизировали с помощью лизирующего буфера, дважды отмывали физиологическим раствором. Численность клеток в органе определяли путем подсчета в камере Го-ряева.
Суспензии обрабатывали моноклональными анти-CD3-антителами, меченными APC (алло-фикоцианин) ("eBioscience", США). Клетки инкубировали с моноклональными антителами в присутствии 0.1%-ного NaN3 в течение 30 мин при 4°С. Трижды отмытые клетки фиксировали параформальдегидом. Проточную лазерную ци-тометрию клеток осуществляли на проточном ци-тометре BD FACSCanto™ II ("Becton Dickinson", США) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения BD FACSDiva и FCS Express.
1 х 106 клеток в 100 мкл физиологического раствора использовали для выделения ДНК с помощью набора "Проба-НК" ("ДНК-Технология", Россия). TREC определяли с помощью ПЦР по общепринятым методикам [5, 11] с некоторыми модификациями.
Для количественного определения кольцевой ДНК, содержащей сигнальные соединительные последовательности sjTREC (signal-joint TREC), методом полимеразной цепной реакции в режиме "реального времени", синтезированы праймеры
sjTREC: прямой 5' - CCAAGCTGACGGCAG-GTTT-3', обратный 5'-AGCATGGCAAGCAG-CACC-3', зонд FAM-5'-TGCTGTGTGCCCTGC-CCTGCC-3'-RTQ-1 [11]. В качестве нормировочного гена выбран константный ген а-цепи Т-клеточного рецептора (TCRA), праймеры к нему: прямой 5' -TGACTCCCAAATCAATGTG- 3', обратный 5'- GCAGGTGAAGCTTGTCTG- 3', зонд FAM-5'-TGCTGGACATGAAAGCTATGGA-3'- RTQ-1 [11].
Для определения абсолютного количества sjTREC в лимфоцитах синтезированы плазмиды — экспериментальная (для определения TREC) и контрольная (для определения нормировочного гена TCRA). Плазмиды получены А.М. Шварцем и Я.А. Литвиным в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН из амплифици-рованного продукта фрагмента ДНК TREC тимуса мыши с последующим лигированием с вектором, трансформацией бактерий E. coli и клонированием. Разведения полученных плаз-мид с известными концентрациями ДНК TREC и TCRA использовали в ПЦР в качестве стандарта.
ПЦР ставили в объеме 25 мкл по следующей программе: 1 цикл — 50°С 2 мин, 95°С 10 мин; 45 циклов — 95°С 15 сек, 60°С 1 мин, использовали прибор "7300 Real-Time PCR System" ("Applied Biosystems"). Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 60°С.
Основным показателем содержания TREC служил индекс TREC/TCRA — отношение числа копий TREC к числу копий TCRA (т.е., фактически, любого гена). В отдельных случаях проводили расчет процента TREC-содержащих Т-клеток (для лимфоузлов и селезенки), а также расчет числа TREC-содержащих клеток на целый орган [11].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представляли в виде Ме (L-H), где Ме — медиана, L — нижний квартиль, Н — верхний квартиль. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использовали ^-критерий Манна—Уитни. Для выявления взаимосвязи переменных проводили расчет коэффициента ранговой корреляции по Спирмену. Различие групп полагали статистически значимым при p < 0.05. Обработку проводили в программном пакете StatSoft Statistica.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Содержание TREC в лимфоиднъх органах. На рис. 1 в графической форме отражено содержание TREC (в виде соотношения TREC/TCRA) в клетках тимуса, лимфатических узлов и селезенки не-
TREC/TCRA, х10-3 60
50 -
40 -
30
20 -
10
Рис. 1. Содержание TREC в лимфоидных органах не-облученных мышей: 1 — тимус, 2 — лимфоузлы, 3 — селезенка.
*р < 0.0001 относительно показателя в тимусе.
облученных мышей. Содержание TREC максимально в тимусе — 0.042 (0.035—0.048), где происходит созревание Т-клеток и образование TREC в ходе перестройки генов TCR. Как уже упоминалось, до 70% тимоцитов, перестроивших гены TCR, содержат TREC. Напротив, во вторичных лимфоидных органах TREC не формируются, а поступают в составе Т-клеток, эмигрирующих из тимуса. Поэтому их содержание в этих органах существенно ниже, чем в тимусе (р < 0.0001).
Сопоставление индекса TREC/TCRA для лимфатических узлов и селезенки дает основание для заключения о более высоком (в 2 раза) удельном содержании TREC в лимфатических узлах по сравнению с селезенкой — 0.013 (0.010—0.016) и 0.006 (0.005—0.007) соответственно, что свидетельствует об определенной избирательности поступления новообразованных Т-клеток в лимфатические узлы (р = 0.00002).
Изменение содержания TREC в тимусе в процессе пострадиационного восстановления. Показатели общей клеточности и содержание ТREC в тимусе мышей в течение 2 мес после общего воздействия у-излучения в дозе 4 Гр представлены в табл. 1. Общеизвестно, что восстановительные процессы в тимусе осуществляются в две стадии, разделенные этапом вторичной атрофии [12]. Их динамика детально рассмотрена в нашей более ранней работе [4].
Изменение индекса TREC/TCRA, а также процента TREC-содержащих Т-клеток следует практически той же динамике
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.