РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 1, с. 54-60
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ НАИВНЫХ Т-КЛЕТОК ПРИ НЕОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ
© 2014 г. Л.В. Кадырова, Н.Ю. Сотникова, А.В. Кудряшова
ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Иваново, Россия
Поступила: 27.11.2013. Принята: 24.01.2014
Цель исследования - изучить содержание CD45RA+CD62L+, CD31+thymic и CD31"central клеток в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов, а также оценить уровень экспрессии ДНК TREC в общем пуле периферических лимфоцитов в динамике неосложненной беременности. Было обследовано 20 небеременных женщин (контроль) и 50 беременных женщин, обследованных троекратно в 1-м, 2-м и 3-м триместрах гестации. Методом проточной цито-флюориметрии в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов исследовали содержание наивных Т-лимфоцитов, CD31+ и CD31- клеток. С помощью PCR в масштабе реального времени определяли уровень экспрессии ДНК TREC в общей фракции периферических лимфоцитов. Наступление беременности сопровождалось увеличением уровня CD45RA+CD62L+ в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов. Уровень CD31+thymic во все сроки неосложненной беременности был ниже аналогичного показателя в группе контроля. Содержание CD31-central клеток на протяжении всего гестационного процесса как в популяции Т-хелпе-ров, так и в популяции ЦТЛ превышало аналогичный показатель в группе небеременных доноров. Анализ нормализованного показателя уровня ДНК TREC относительно показателей небеременных доноров выявил отсутствие достоверных изменений в 1-м триместре беременности, снижение данного показателя во 2-м триместре беременности и последующее его повышение практически до уровня небеременных доноров в 3-м триместре гестации. Таким образом, во время беременности высокий уровень наивных Т-клеток в популяции периферических Т-хелперов и ЦТЛ определяется процессом внетимической дифференцировки лимфоцитов, о чем свидетельствуют снижение содержания CD31+ и повышение уровня CD31- лимфоцитов.
Ключевые слова: наивные Т-лимфоциты, TREC, беременность
ВВЕДЕНИЕ
Как известно, Т-клеточный гомеостаз в организме определяется балансом между процессами образования лимфоидных клеток и их гибели [1]. Тимус является основным источником наивных Т-клеток и играет ключевую роль в установлении и поддержании периферического Т-клеточно-го пула [2]. Наивные клетки имеют фенотип СВ45КЛ+СВ62Ь+ССК7 + СБ28 + . Эти лимфоциты не примированы в отношении антигена и слабо продуцируют отдельные цитокины,
Адрес: 153003, г. Иваново, ул. Красных Зорь, д. 14, кв. 63, Сотниковой Н.Ю. E-mail: niimid.immune@mail.ru
такие, например, как 1Ь-2 [3]. Известно, что у взрослых людей наивные Т-лимфоциты про-лиферируют с небольшой интенсивностью, так как делению на периферии подвергается около 1%, СБ4+ и СБ8+ клеток [4]. При многих аутоиммунных заболеваниях, лимфомах, вирусно-бактериальных процессах наблюдается изменение показателей Т-клеточного го-меостаза (общего количества лимфоцитов, соотношения СБ4+/СБ8 + , СБ45КЛ+/С045К0 + лимфоцитов и др.), и механизмы пополнения наивных Т-клеток в этих условиях отличаются от таковых в норме.
Иммунная система матери во время беременности подвергается воздействию целого ряда факторов [5, 6, 7], что может определять включение иных механизмов поддержания Т-клеточного гомеостаза при данном физио-
логическом состоянии. Известно, что беременность сопровождается атрофией тимуса, выраженной в снижении его массы и кле-точности, главным образом за счет атрофии коркового слоя и истощения популяции кортикальных тимоцитов [8]. Но это не вызывает изменений в абсолютном содержании периферических лимфоцитов на всем протяжении гестации [9]. Можно предположить, что во время беременности механизмом компенсации частичного подавления тимического пути развития лимфоцитов является процесс экс-тратимической дифференцировки Т-клеток. Так, в работах ряда авторов была показана экстратимическая дифференцировка лимфоцитов в лимфатических узлах, дренирующих матку, и в печени во время беременности [10, 11]. Кроме того, постоянный уровень Т-лим-фоцитов при патологических состояниях, связанных с нарушением тимической диф-ференцировки, может компенсироваться гомеостатической пролиферацией наивных клеток на периферии [12].
В настоящее время для изучения функциональной активности тимуса применяют метод определения в лимфоцитах колец реаранжи-ровки генов а-цепи антигенраспознающего рецептора или TREC (T-cell receptor rearrangement excision circles). TREC формируется при перестройке генов Т-клеточного рецептора в тимоцитах, при этом образуется последовательность кольцевой ДНК, которая присутствует только в наивных Т-лимфоцитах и в последующем не реплицируется при их митозе. В случае внетимического созревания Т-лимфоцитов TREC в клетках не определяется. Следовательно, измерение количества TREC позволяет выявить клетки, недавно вышедшие из тимуса, и, таким образом, оценить функциональную активность тимуса [13, 14].
В литературе имеются работы о снижении уровня TREC при патологических состояниях, таких, как вариабельный неклассифици-руемый иммунодефицит, кожная Т-клеточная лимфома, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, ВИЧ-инфекция [15—19]. Однако при различных физиологических состояниях характер экспрессии TREC остается малоизученным. Так, в основном приводятся данные о снижении с возрастом количества TREC в Т-лимфоцитах на периферии, что говорит о снижении функциональной активности тимуса [20]. Это позволяет предположить, что при транзиторной атрофии тимуса во время беременности должен изменяться уровень
экспрессии ТИЕС периферическими лимфоцитами. Но в литературе имеется лишь одна работа о снижении уровня ТИЕС у беременных женщин во 2 триместре гестации относительно показателей у небеременных женщин [21].
Наряду с исследованием уровня экспрессии ТИЕС лимфоцитами в качестве маркера недавно мигрировавших из тимуса клеток предлагается рассматривать молекулу СБ31 [22]. Молекула СБ31, известная также как РЕСАМ-1, относится к адгезионным молекулам межклеточного взаимодействия семейства 1д-подобных белков. СБ31 экспрессиру-ется на поверхности наивных Т-лимфоцитов, недавних выходцах из тимуса, а внетими-ческое созревание наивных Т-лимфоцитов совпадает с прогрессирующим уменьшением экспрессии СБ31 [23]. На основании этих данных в настоящее время предлагается выделять СБ31+Шут1с и СБ31-сеп1га1 наивные Т-лимфоциты [24]. Различные авторы говорят о том, что у человека доля СБ31-позитивных СБ4+ и СБ8 + лимфоцитов коррелирует с объемом тимуса, уровнем ТИЕС и снижается с возрастом [25, 26].
Целью нашего исследования было изучить содержание наивных СБ45КА+СБ62Ь+, СБ31+Шут1с и СБ31-сеп1га1 клеток в популяциях Т-хелперов (СБ4+) и цитотоксических Т-лим-фоцитов (СБ8 + ), а также оценить уровень экспрессии ДНК ТИЕС в общем пуле периферических лимфоцитов в динамике неослож-ненной беременности.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материалом для исследований служила периферическая венозная кровь из локтевой вены 70 женщин. Из них 20 соматически здоровых небеременных женщин с реализованной репродуктивной функцией (небеременные доноры) и 50 беременных женщин, обследованных троекратно: в 1-м триместре (6—10 недель), во 2-м триместре (16 — 20 недель) и в 3-м триместре гестации (30 — 34 недели). Выделение из периферической крови общей фракции мононуклеарных клеток осуществляли традиционным методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в градиенте плотности фиколл-урографина 1,078). Методом трехцветной проточной цитофлюориметрии в популяциях СБ4+ и СБ8 + лимфоцитов исследовали содержание наивных Тп (СБ45КА+СБ62Ь+), СБ31 + и
CD31- клеток на цитометре FACSCanto II с использованием программного обеспечения FACSDiva (Becton Dickinson, США). В работе использовали моноклональные антитела анти^4 PerCP-Cy5.5 (eBioscience, США), анти-CDB PerCP-Cy5.5 (eBioscience, США), анти-CD45RA АРС (eBioscience, США), анти-CD62L FITC (eBioscience, США), анти^31 PE-Cy7 (eBioscience, США).
Для определения экспрессии ДНК TREC в общей фракции периферических лимфоцитов использовали метод полимеразной цепной реакции (PCR) в масштабе реального времени. В работе использовали набор реагентов для определения гена TREC (ООО «Синтол», Россия), для определения гена 18s rRNA (Biosourse, США). Анализ производился на приборе iQCycler (Bio-Rad, США). При анализе данных использовали стандартный полуколичественный Ct-метод определения уровня экспрессии ДНК специфических генов. Для этого в каждом образце одновременно определялся пороговый цикл амплификации Ct для ДНК TREC и 18s rRNA, который использовался в качестве гена домашнего хозяйства. Затем уровень экспрессии ДНК TREC нормализовали относительно экспрессии ДНК 18s rRNA. Для этого рассчитывался показатель ACt по формуле:
ACt = Ct-TREC - Ct-18s rRNA.
Для полуколичественной оценки результатов RT-PCR, уровень экспрессии ДНК TREC в группе беременных женщин нормализовали относительно соответствующего показателя в контрольной группе. Для этого рассчитывался коэффициент RQ (related quantity) по стандартной формуле [27]
RQ= 2 (-AACt), где
AACt = ACt беременные женщины - ACt контроль.
Таким образом, все результаты представлены как n-кратные различия между соответствующими показателями в группе беременных женщин и небеременного донора.
Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2000. Результаты представлены как среднее арифметическое ± ошибка среднего арифметического. Достоверность различий сравниваемых показателей оценивали с использованием критериев Стьюдента и Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты проведенных исследований показали, что наступление беременности сопровождалось достоверным увеличением уровня наивных клеток с фенотипом СБ45КЛ+СВ62Ь+ как в популяции Т-хелперов, так и в популяции цитотоксических лимфоцитов (р < 0,05 в обоих случаях) по сравнению с аналогичным показателем группы небеременных донор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.