БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2010, том 27, № 6, с. 489-497
УДК 611.018.1+612.8
ДИНАМИКА УЛЬТРАСТРУКТУРНЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ СПАРЕННЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ
© 2010 г. О. С. Сотников, Н. М. Парамонова, Л. И. Арчакова*
Учреждение Российской академии наук Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 199034, Санкт-Петербург, Набережная Макарова, 6; тел. (813) 70-72-537; электронная почта: Sotnikov@kolt.infran.ru *Институт физиологии НАНБеларуси, 220725 Минск, Академическая ул., 28; тел. (10375) 17-284-17-82;
электронная почта: biblio@fizio.bas-net.by Поступила в редакцию 10.03.2010 г.
Исследованы механизмы формирования наноскопических пор и крупных синцитиальных перфораций спаренных мембран нейронов, нейрона и глии, многослойных глиальных оболочек, а также эндоплазматической сети и аппарата Гольджи. Механизм формирования пор и перфораций во всех случаях сходен. Сближение мембран приводит к их слиянию с образованием протяженных и точечных структур, напоминающих плотные контакты (tight junctions). Поры и их расширения — перфорации образуются только на базе мембранных контактов. Межмембранная щель при этом формирует варикозную, четкообразную форму. Пора между варикозностями образуется в результате превращения эллипсоидной формы в сферическую. При аутоампутации варикозных везикул они превращаются в остаточные тельца в просвете перфораций.
Ключевые слова: мембранные поры, межнейрональный синцитий, глио-нейрональный синцитий, глио-глиальный синцитий.
Барьерные свойства наружной клеточной мембраны нейрона являются важнейшими в обеспечении его основной функции — возбуждения и проведения. Нарушение проницаемости нейромем-браны при образовании в ней пор сопровождается изменением, не всегда патологическим, процессов электрогенеза. Поры — наноскопические образования, но их размер широко варьирует [1]. Изучены условия спонтанной порации бислойных мембран под влиянием перераспределения лизолипи-дов и холестерина [2, 3] за счет тепловых флуктуаций [4]. Поры либо спонтанно закрываются, либо превращаются в "закритические" [5] и разрывают мембрану. Разработаны методы формирования пор и последующего слияния клеток с помощью искусственной электропорации спаренных мембран контактирующих клеток, воздействия лазера, использования полиэтиленгликоля, вируса Сендай, протаминсульфата, латекса полистирола и др. Электропорация предполагает преобразование наноскопических пор 5—7 нм (по Г.В. 1асс и Л.В. Черномордику [6]) в крупные син-цитиальные перфорации с последующим слиянием клеток, поэтому она широко используется при гибридизации клеток. Как известно, липиды "не терпят" краев. Биологические мембраны, как любые другие липидные мембраны, благодаря гидрофобному взаимодействию липидов стремятся сформировать замкнутые структуры. Кромка поры билипидной мембраны имеет закругленную полу-
сферическую форму. Сравнительно высокой устойчивостью обладают везикулы сферической формы [4, 7].
При слиянии липосом с эритроцитами была отмечена еще одна особенность. Среди структурных изменений мембран, предшествующих образованию пор, отмечается появление пятислойных мембранных структур, напоминающих плотные мембранные контакты [8]. Однако четких доказательств интенсивного включения липосом в плазматическую мембрану вне областей пентала-минарных контактов обнаружить не удалось. В статье Н.В. Самосудовой и соавт. [9] прямо сказано, что пятислойный контакт можно рассматривать как начальную фазу слияния миогенных клеток. В большинстве работ, направленных на изучение эмбриогенеза скелетных мышц, формирование пяти-слойных межклеточных контактов рассматривается как обязательная стадия, предшествующая слиянию миогенных клеток.
В исследованиях электрического пробоя мембраны удалось определить кинетику накопления пор, изменение их размеров, а также процесс обратного развития [10]. Исследовали также и ультраструктуру клеток, подвергнутых действию электрического тока, достаточного для электро-порации [8]. Следует отметить, что при анализе проблемы слияния клеток в ряде работ обсуждается вопрос порообразования в бислойной мембране, хотя на самом деле речь должна идти о
пробое двух спаренных бислойных мембран. По нашему мнению, сближение наружных клеточных мембран может способствовать их структурной дестабилизации и образованию сквозных синцитиальных мембранных пор [11]. Недостаточно изученной остается также ультраструктурная основа этого процесса.
Целью настоящей работы было электронно-микроскопическое исследование образования спонтанных синцитиальных пор и перфораций между спаренными мембранами смежных нервных клеток. В отличие от образования мембранных пор и цитоплазматических мостиков у клеток всех других типов [12], для нейронов этот вопрос имеет особое значение, так как по ортодоксальной нейронной теории межнейронная связь осуществляется исключительно с помощью синапсов, а синцитиальная связь нервных клеток невозможна в принципе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мы рассчитывали выявить общие свойства различных спаренных мембран, поэтому нам пришлось анализировать ультраструктуру нескольких объектов. Были исследованы нейроны зубчатой извилины и полей СА1и CA2 гиппокам-па пяти кроликов породы Шиншилла, для которых характерно почти полное отсутствие глиаль-ных оболочек и плотное прилегание нейролемм соседних нейронов. Животных умерщвляли в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" 1977 года. У предварительно наркотизированных тиопенталом натрия кроликов выделяли гиппо-камп и до фиксации рассекали его на тонкие (толщиной 1—2 мм) фронтальные срезы.
Взаимоотношение глиальных и нейрональных мембран изучали в периферической нервной системе речного рака Astacus leptodactylus (пять особей), выловленных в Ленинградской области.
Динамику перестройки спаренных мембран эндоплазматической сети анализировали в нейронах моллюска Lymnaea stagnalis (15 животных). После выделения окологлоточного кольца ганглиев изолировали отдельные ганглии от коннек-тивов и нервов и помещали на 40 мин при 20°С в 0.4% раствор проназы (Pronase Streptomyces gri-seus, Serva), приготовленный на изотоническом растворе Рингера для моллюсков, который содержал (мМ) 90 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1.5 MgCl2, 0.3 трис (Sigma). При обработке ганглиев прона-зой более раннему и большему повреждению подвержены элементы соединительной ткани и глии. Это связано с тем, что они входят в состав наружных оболочек и первыми вступают во взаимодействие с проназой. Повреждаемость глии зависит также от того, что глиальные клетки имеют очень
большую поверхность своих ламелл и соответственно крайне большое отношение площади наружной мембраны к объему клетки, т.е. располагают очень низкой термодинамической и структурной устойчивостью. Они всегда первыми реагируют на внешние воздействия.
По истечении 40 мин содержания в проназе ганглии отмывали от протеолитического фермента в изотоническом растворе и снимали с них соединительнотканную оболочку. После этого проводили процедуру многократного всасывания ганглиев (пипетирования) в Г-образные стеклянные микропипетки с диаметром кончиков 0.8 и 0.6 мм. В результате удавалось получить значительное количество изолированных, лишенных глии нейронов. Перед электронно-микроскопическим фиксированием клетки агрегировали центрифугированием. (Подробнее см. [13].)
Спаренные мембраны цистерн аппарата Голь-джи анализировали в нейронах корковой пластинки полушарий большого мозга 8-недельных плодов человека. После операции прерывания беременности кусочка мозга величиной 1—3 мм3 помещали в культуральную среду 199 на 3—4 ч. Далее мозг фиксировали для электронной микроскопии. Все препараты фиксировали одинаковым традиционным методом в 2.5% глутаровом альдегиде на 0.1 М какодилатном буфере (pH 7.4) при температуре 4°С в течение 1.5 ч. Постфиксацию проводили в 1% растворе охлажденной четы-рехокиси осмия в течение 1 ч. После дегидратации в растворах этилового спирта восходящей концентрации материал заливали в смесь аралди-тов. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме LKB-5 (Швеция) и окрашивали методом тройного контрастирования по Рейнольдсу. Просмотр и фотосъемку проводили в электронном микроскопе LEO 10 (Германия) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Негативы сканировали в просвечивающем режиме с помощью сканера UMAX Astra 4000V (Тайвань).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Синцитиальные межнейронные перфорации и поры в гиппокампе. Большинство нейронов мозга, как известно, имеют сплошную, а иногда и многослойную глиальную оболочку. Оригинальная особенность нервных клеток гиппокампа состоит в том, что они покрыты глией лишь частично, а часто на ультратонких срезах парацеллюлярная глия у нейронов вообще отсутствует. Остальная поверхность клеток контактирует с мембранами соседних клеток. Непокрытыми глией могут оказаться и контактирующие мембраны нескольких смежных нейронов. В области таких спаренных мембран образуются мембранные контакты. На наших препаратах наиболее частым структурным явлением во взаимоотношении спаренных мем-
Рис. 1. Протяженные (а) и точечные (б) структуры, напоминающие плотные контакты спаренных мембран двух прилегающих тел нейронов гиппокампа. ГЭР — гранулярный эндоплазматический ретикулум, Н1-2 — цитоплазма смежных нейронов, треугольные стрелки — протяженные и точечные плотные контакты, масштабная черта — 0.1 мкм.
бран в асинаптической области нейронов гиппокампа было образование пенталаминарных контактов, напоминающих плотные контакты (tight junction) (рис. 1а). Иногда контакты занимают до 4% наружной клеточной поверхности мембраны в препарате. В некоторых местах они располагались редко, но имели длину до 100 нм и более. В других же участках встречались короткие "точечные" плотные контакты, расположенные группой на небольшом расстоянии ~40—80 нм друг от друга. В этом случае межклеточная щель принимала варикозную, четкообразную форму, где сужения щели чередовались с ее некоторыми расширениями (рис. 1б).
Особенность отмеченных мембранных контактов состояла в том, что часть из них имела мелкие поры и более крупные перфорации (рис. 2). Едва заме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.