ОНТОГЕНЕЗ, 2011, том 42, № 2, с. 133-145
ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ
УДК 591.392
ДИСПЕРМНЫЙ АНДРОГЕНЕЗ У ОСЕТРОВЫХ РЫБ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ СПЕРМЫ: ПОЛУЧЕНИЕ АНДРОГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОТОМСТВА СИБИРСКОГО ОСЕТРА И АНДРОГЕНЕТИЧЕСКИХ ГИБРИДОВ МЕЖДУ СИБИРСКИМ
И РУССКИМ ОСЕТРАМИ1
© 2011 г. А. С. Грунина, А. В. Рекубратский*, Л. И. Цветкова*, А. Е. Барминцева**, Е. Д. Васильева***, К. В. Ковалев*, О. Г. Полуэктова**
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26
Е-шаП: asgrunina@gmail.com *Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйства, 141821 п. Рыбное, Московская область **Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии, 107140 Москва, ул. Верхняя Красносельская, д. 17 ***Зоологический музей МГУ, 125009Москва, ул. Большая Никитская, д. 6 Поступила в редакцию 28.06.2010 г. Окончательный вариант получен 07.10.2010
Впервые благодаря применению метода диспермного андрогенеза получены андрогенетическое потомство сибирского осетра (Acipenser ЬаегИ) и андрогенетические ядерно-цитоплазматические гибриды (сибирский осетр, АЫретег ЬаегИ х русский осетр, А. gueldenstaedtii) у осетровых рыб с использованием криоконсервированной спермы. С помощью анализа микросателлитной ДНК подтверждена чисто отцовская наследственность у андрогенетического потомства сибирского осетра. Среди андрогенетических гибридов выявлены гетерозиготы по некоторым микросателлитным ло-кусам, что подтверждает диспермную природу андрогенеза. По данным сравнительного морфологического анализа полученный андрогенетический гибрид к 15-месячному возрасту полностью идентичен отцовскому виду. В полученных андрогенетических потомствах осетровых рыб выявлены как самка, так и самец, что представляет интерес с точки зрения возможности получения с помощью андрогенеза бисексуальных потомств. Данные настоящего исследования подтверждают возможность применения метода диспермного андрогенеза в сочетании с использованием крио-консервированной спермы для сохранения и воссоздания генофондов исчезающих видов осетровых рыб.
Ключевые слова: диспермный андрогенез, осетровые рыбы, криоконсервированная сперма, микро-сателлитный анализ, гетерозиготность, андрогенетические ядерно-цитоплазматические гибриды, сравнительный морфологический анализ, определение пола, гистологический анализ.
Индуцированный андрогенез является методом получения организмов с исключительно отцовской ядерной наследственностью и традиционно применяется в генетике и биологии развития для получения высокоинбредных линий и клонов, изучения взаимоотношений ядра и цитоплазмы, регуляции пола и др. В последнее время метод привлекает особое внимание в связи с возможностью использования его для восстановления редких и исчезающих видов из генетического материала их спермиев (Ve-printsev, Rott, 1979; Grunina et al., 1990; Corley-Smith,
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проекты 09-04-01695, 06-04-49637 и 07-0400219) и подпрограммой "Биоразнообразие" Президиума РАН (проект № 6.1.8).
Brandhorst, 1999). Значение этого подхода к проблеме сохранения ценных генофондов в существенной мере определяется тем, что технология длительного хранения спермы рыб посредством криоконсерва-ции уже в основном разработана (Suquet et al., 2000).
Для получения диплоидного андрогенеза необходимо вызвать инактивацию ядер яйцеклеток и ди-плоидизацию (удвоение) мужского хромосомного комплекса. К настоящему времени диплоидный андрогенез успешно осуществлен у ряда видов костистых рыб с помощью радиационной инактивации ядер яйцеклеток и диплоидизации мужских хромосом за счет блокирования первого деления дробления у андрогенетических гаплоидных зародышей (см. обзоры: Penman et al., 1996; Grunina, Neyfakh,
1997). Однако полученные нами тем же способом андрогенетические диплоиды осетровых рыб оказались нежизнеспособны вследствие повышенной чувствительности этих рыб к высокому уровню го-мозиготности, возникающей в результате блокирования первого деления дробления (Грунина, Ней-фах, 1991). Между тем работы в данном направлении на осетровых рыбах имеют первостепенное значение, поскольку многие виды и популяции этих рыб близки к исчезновению (Birstein et al., 1997).
Для преодоления гомозиготности андрогенети-ческих особей нами применительно к осетровым рыбам разработан метод диспермного андрогенеза. Данный метод предполагает диплоидизацию за счет слияния хромосомных наборов двух спермиев, что приводит к получению гетерозиготного потомства с обычным уровнем генетической изменчивости. Разработанный метод диспермного андрогенеза основывается на биологических особенностях осетровых рыб — наличии в яйцеклетках нескольких микропиле и физиологической моноспермии (отсутствие в яйцеклетках механизмов, блокирующих сверхчисленные спермии) (Гинзбург, 1968) - и включает радиационную инактивацию ядер яйцеклеток, полиспермное оплодотворение и тепловой шок, способствующий слиянию мужских пронуклеусов. С помощью этого метода нами были впервые получены жизнеспособные андрогенетические потомства у нескольких видов осетровых рыб (Grunina etal., 1995; Recoubratsky et al., 1996; Грунина, Рекуб-ратский, 2005), а также жизнеспособные андрогене-тические ядерно-цитоплазматические гибриды (Грунина, Рекубратский, 2005; Grunina et al., 2009). Получение подобных гибридов является необходимым условием, определяющим возможность использования андрогенеза для восстановления редких и исчезающих видов. При этом предполагается, что, оплодотворяя нативной или криоконсервиро-ванной спермой такого вида генетически инактиви-рованные яйцеклетки доступного близкого вида и используя метод диплоидного андрогенеза, можно воссоздать исчезающий вид (Grunina, Neyfakh, 1997).
В данном сообщении отражены последние результаты наших исследований по диспермному ан-дрогенезу у осетровых рыб с использованием крио-консервированной спермы. Впервые приводятся данные о получении таким путем андрогенетиче-ского потомства сибирского осетра (Acipenser baerii) и андрогенетических ядерно-цитоплазматических гибридов. В качестве экспериментальных объектов для получения этих гибридов использованы сибирский (A. baerii) и русский (A. gueldenstaedtii) осетры (соответственно, материнский и отцовский виды). Для подтверждения чисто отцовской наследственности у андрогенетических особей сибирского осетра, а также андрогенетической природы полученных ядерно-цитоплазматических гибридов использован микросателлитный анализ. Для иденти-
фикации андрогенетических гибридов использован сравнительный морфологический анализ. Также впервые приводятся данные по изучению пола у андрогенетических осетров, в том числе с использованием гистологического анализа.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материал. Эксперименты по индуцированному андрогенезу проводились в 2006-2008 гг в Институте биологии развития РАН. В качестве материала использовали половые продукты, полученные от производителей сибирского осетра, содержащихся на Конаковском заводе товарного осетроводства (Тверская область), а также криоконсервированную сперму русского осетра, заготовленную на рыбоводных заводах Краснодарского края. До использования в опытах эта сперма хранилась в криобанке в течение 2-х лет.
В опытах использовали яйцеклетки сибирского осетра, криоконсервированную или нативную сперму сибирского осетра и криоконсервированную сперму русского осетра. В каждом опыте использовали яйцеклетки, полученные от одной-трех самок, и смесь спермы от трех самцов для каждого вида.
Замораживание и размораживание спермы
Сперму замораживали в 1.5 мл центрифужных пробирках по стандартной методике (Tsvetkova et а1., 1996). Криозащитная среда содержала метанол (10%), сахарозу (7%) и антифризные белки. Для размораживания пробирки помещали на 1 мин в водяную баню (40°С), затем полуразмороженную сперму извлекали из пробирок, разбавляли водой и приливали к икре. Через 3 мин после осеменения яйцеклетки отмывали от криопротектора путем трехкратной смены воды.
Получение андрогенетического потомства
Для инактивации ядер яйцеклетки подвергали рентгеновскому облучению в дозе 220 Гр. Затем, спустя 1.4—1.6 т0 (т0 см. Dett1aff et а1., 1993) после осеменения нативной (разбавление водой 1 : 10) или размороженной (разбавление 1.5 : 10) спермой, их подвергали тепловому шоку при 37°С в течение 2 мин. Ранее установлено, что шок в период развития от 1.4 до 1.6 т0 является оптимальным для индукции диплоидного андрогенеза за счет слияния ядер спер-миев (диспермный андрогенез) у осетровых рыб (Recoubratsky et а1., 1996). Меньшее разбавление криоконсервированной спермы было взято исходя из того, что часть спермиев после процедур замораживания и оттаивания теряет подвижность. При получении обычного (интактного) потомства сперму разбавляли в соотношении 1 : 100, что позволяло избежать полиспермного оплодотворения.
В параллельных вариантах опытов для сравнения результатов использовали криоконсервированную и нативную сперму.
В каждом опыте по диспермному андрогенезу, помимо экспериментальных андрогенетических диплоидных потомств (АД — диплоидный андроге-нез), были получены следующие контрольные варианты: КД (контроль диплоидный) — обычное скрещивание без применения экспериментальных воздействий; КГ (контроль гаплоидный) — андроге-нетическое потомство (облучение икры), полученное без применения теплового шока. В контрольных вариантах были использованы те же гаметы, что и в опытных. Все варианты опытов проводились в трех-четырех повторностях.
Инкубация эмбрионов и выращивание личинок
Эмбрионов инкубировали в чашках Петри диаметром 90 мм (100—150 шт. на чашку) при комнатной температуре. Регулярно отбирали погибших эмбрионов. Полученных личинок после перехода на экзогенное питание переводили на выращивание в аквариальную ИБР РАН, где они содержались при температуре около 20°C и получали живые и искусственные корма.
Молекулярно-генетический анализ
Для анализа ДНК образцы тканей рыб фиксировали в 96%-ном этаноле. Из полученных образцов выделяли ДНК методом фенольно-хлороформово
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.