РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2011, том 51, № 6, с. 651-659
ЭФФЕКТ СВИДЕТЕЛЯ
УДК [57+61]::539.1.04:577.18.04:577.354.3
"ДНК-СИГНАЛЬНЫЙ" ПУТЬ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЙ РАЗВИТИЕ РАДИАЦИОННОГО ЭФФЕКТА СВИДЕТЕЛЯ В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА
© 2011 г. А. В. Ермаков, М. С. Конькова, С. В. Костюк, Н. Н. Вейко*
Медико-генетический научный центр (МГНЦ) РАМН, Москва
Воздействие ионизирующего излучения в малых дозах индуцирует развитие в клетках человека адаптивного ответа, сопровождающегося рядом клеточных реакций. Аналогичные реакции за счет межклеточной сигнализации могут развиваться и в соседних необлученных клетках (эффект свидетеля, ЭС). Главная роль в радиационном ЭС принадлежит окислительному стрессу и "ДНК-сигнальному" пути, в котором фактором стресс-сигнализации являются фрагменты свободной внеклеточной ДНК, образующейся в результате апоптоза некторых клеток. Цепочку последовательных событий в этой сигнальной системе мы видим следующей: облучение —- первичный окислительный стресс —► модификация ДНК —»- апоптоз поврежденных клеток —»- свободная модифицированная внеклеточная ДНК —- прием сигнала необлученными клетками —- вторичный окислительный стресс —»- модификация ДНК и т.д. Индуцированный радиацией ЭС с участием "ДНК-сигнального" пути наблюдался в недифференцированных и дифференцированных клетках человека, образующих суспензионные или монослойные культуры. В работе обсуждаются некоторые аспекты механизма радиационного ЭС и возможность его персистирования.
Настоящая статья представляет собой краткий обзор результатов ряда работ, выполненных сотрудниками лаборатории молекулярной биологии МГНЦ РАМН за последние годы и опубликованных в отечественной и зарубежной печати. Это серия исследований — еще далеко незавершенная — развития некоторых клеточных реакций, играющих существенную роль в молекулярных механизмах мутагенеза и биологии клетки в целом: адаптивного ответа и эффекта свидетеля, которые индуцировали в клетках человека воздействием рентгеновского излучения в адаптирующей дозе (10 сГр). Исследование выполнено на человеческих клетках разных типов: С0-лимфо-цитах периферической крови [1—8], эндотелиаль-ных клетках вены пуповины человека (HUVEC) [9], мезенхимальных стволовых клетках (МСК) жировой ткани [10, 11] и раковых стволовых клетках молочной железы [12].
Для удобства уважаемых читателей приводим список используемых сокращений: АО — адаптивный ответ АФА — активные формы азота АФК — активные формы кислорода БСА — бычий сывороточный альбумин вкДНК — внеклеточная ДНК ДР ДНК — двунитевые разрывы ДНК МСК — мезенхимальные стволовые клетки ОС — окислительный стресс
*Адресат для корреспонденции: 115478 Москва, ул. Москворечье, 1, МГНЦ РАМН; тел.: (499) 612-81-93; факс: 324-0702; e-mail: ribgene@rambler.ru.
СС — стресс-сигнализация ЭС — эффект свидетеля.
ЭФФЕКТ СВИДЕТЕЛЯ И АДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ
Уже более 50 лет назад началось исследование влияния одних клеток на другие, осуществляемое с помощью так называемых факторов стресс-сигнализации. С каждым годом работ подобного рода становилось все больше, исследования приобретали более детальный характер, пока в 1992 г. факт межклеточной сигнализации не был экспериментально воспроизведен на культуре клеток китайского хомячка [13]. После облучения не более 1% клеточных ядер наблюдали увеличение частоты сестринских хроматидных обменов в 20— 40% культивируемых клеток. Эффект передачи информации от облученных клеток (клеток-мишеней) необлученным (клеткам-свидетелям) получил название "bystander effect" или "эффект свидетеля" (ЭС). За последние годы накоплено большое количество данных, подтверждающих этот феномен. ЭС показан для повреждающих агентов как физической, так и химической природы, для многих типов клеток — от одноклеточных до человека, — а также для ряда передаваемых реакций и эффектов, в том числе апоптоза и адаптивного ответа (АО). В результате индукции воздействием ионизирующей радиации в малых дозах адаптивной реакции в клетках развивается устойчивость к последующему облучению в высоких (повреждающих) дозах. Например, адаптирующим предоблучением на 50—60% может быть
снижено количество ожидаемых генных и хромосомных мутаций. АО может передаваться интакт-ным клеткам по механизму ЭС [14, 15]; обе реакции (АО и ЭС) тесно взаимосвязаны биологически и имеют много сходных черт и характерных признаков [16—20]. Принято считать, что существуют три возможных пути передачи сигнала "свидетелю": непосредственный клеточный контакт с образованием общих мембранных структур, взаимодействие через щелевидные контакты или через среду культивирования облученных клеток. Для ЭС, индуцированного излучением с низкой ЛПЭ, характерен третий путь [21]. На роль факторов стресс-сигнализации (СС) между клетками-мишенями и клетками-свидетелями предложено много кандидатов, в основном белков. Все упомянутое выше в связи с ЭС подробно изложено в ряде основательных публикаций обзорного типа [20, 22—30 и др]. Результаты продолжительного исследования в нашей лаборатории роли свободной, внеклеточной ДНК (вкДНК), циркулирующей в крови здоровых людей и при патологии, навели нас на мысль, что вкДНК может, кроме всего прочего, являться передающимся через среду обитания клеток фактором СС и индуцировать, таким образом, развитие радиационного эффекта свидетеля. В дальнейших исследованиях мы подтвердили это предположение, впервые показав значение "ДНК-сигнального" пути для клеток, подвергающихся облучению в малых дозах.
"ДНК-СИГНАЛЬНЫЙ" ПУТЬ
Реакция клеток-мишеней на облучение в малой дозе и апоптоз
Известно, что АО развивается после воздействия на клетки ионизирующей радиации с низкой ЛПЭ в малых дозах (0.01—20 сГр) [24]. Кроме того, на мышах было показано, что при постепенном увеличении дозы облучения вне пределов этого диапазона, например, выше 15 сГр или ее уменьшении ниже 2.5 сГр адаптивная реакция начинает быстро терять свою эффективность и затем не проявляется вовсе [31]. Опираясь на мнение ряда авторов [20, 32] и цитируемые ими работы, мы полагаем, что в исследованных нами клетках выраженный АО имеет место после воздействия ионизирующего излучения в средней для приведенного диапазона (0.01—20 сГр) дозе — 10 сГр. Логично считать, что наблюдаемые вслед за облучением морфологические и функциональные изменения в клетках имеют непосредственное отношение к развитию адаптивной реакции и, таким образом, могут характеризовать ее эффективность. Поэтому в нашей работе анализировались разные параметры клеток-мишеней и клеток-свидетелей после воздействия рентгеновского излучения в дозе 10 сГр. К "опорной" груп-
пе таковых параметров относятся некоторые цитологические характеристики клеточных ядер: взаиморасположение прицентромерных участков интерфазных хромосом по отношению к центру ядра или друг к другу, равно и как изменение формы ядра (если она не сферическая). Мы полагаем
[33], что на начальных стадиях развития АО происходит транспозиция (перемещение) некоторых участков гомологичных хромосом из примем-бранных областей ядра к его центру. Это было показано после воздействия в адаптирующих дозах (3—10 сГр) рентгеновского излучения на лимфоциты человека и регистрации прицентромерных районов хромосом при помощи С-окрашивания
[34]. Тот же феномен внутриядерной транспозиции локусов наблюдался для прицентромерных районов (1q12) гомологов хромосомы 1 человека
[35], которые рассматриваются как маркеры структурных изменений хроматина в ответ на внешнее воздействие.
После облучения (10 сГр) в ядрах клеток человека происходят структурные преобразования [1—12], исследованные нами с помощью флуоресцентной микроскопии (метод FISH), компьютерной программы анализа изображений ("Images-EL") и оригинальных алгоритмов, разработанных для этой цели в лаборатории. Прицентромерные локусы первой хромосомы в интактных ядрах анализируемых клеток локализованы в основном примембранно. Это находит свое отражение на кумулятивных гистограммах частотного распределения значений гибридизационного сигнала локуса 1q12 хромосомы 1 по нормированному радиус-вектору (г). После воздействия рентгеновского излучения изменяется профиль распределения г: уменьшается количество клеток с при-мембранным расположением прицентромерных локусов (г > 0.8) и увеличивается число клеток с их внутриядерной локализацией (г < 0.8). После облучения изменяется еще один параметр ядра, регистрируемый аналогичным методом: нормированное расстояние между сигналами (d) на гомологах по отношению друг к другу [9]. Показано, что воздействие рентгеновского излучения индуцирует сближение участков гомологичных хромосом в пространстве клеточного ядра. Кроме того, меняется и другой параметр, отражающий форму ядра — если она не сферическая, как у лимфоцита, а эллипсоидная (эндотелиоциты и МСК жировой ткани): это соотношение большой и малой осей эллипсоида [9]. После облучения ядро таких клеток принимает более сферическую, т. е. более компактную форму. Вызванные облучением изменения анализируемых параметров указывают на существенные перемены в структурной организации интерфазного хроматина, связанные с развитием АО. По-видимому, эта реакция направлена на ожидаемую репарацию множественных повреждений ДНК, которые могут быть
индуцированы облучением в высокой дозе. Мы полагаем, и это не расходится с мнением других авторов [36, 37], что АО направлен в основном на репарацию двунитевых разрывов ДНК (ДР ДНК). Действительно, трудно отрицать, что структурная перестройка хроматина — индуцируемое облучением перемещение в пространстве ядра тех или иных участков хромосом — необходима для изменения спектра экспрессируемых при развитии АО генов, а сближение самих хромосом — это благоприятная реакция для последующей элиминации ДР ДНК в репарационных процессах при гомологичной рекомбинации (HR) или негомологичного соединения концов нитей ДНК хромосом (NHEJ). Факт транспозиции хромосомных локу-сов при действии радиации в адаптирующей дозе, продемонстрированный нами для лимфоцитов [1—8], эндотелиальных клеток человека [9], для мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [10, 11] и раковых стволовых клеток м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.