ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 6, с. 893-904
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 581.1
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КЛИК-РЕАКЦИИ 5-ЭТИНИЛ-2-ДЕЗОКСИУРИДИНА С АЗИДАМИ ФЛЮОРОХРОМОВ В ИЗУЧЕНИИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА И МЕТАБОЛИЗМА ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОЗИДОВ © 2014 г. А. В. Носов*, А. А. Фоменков*, А. С. Мамаева*, А. Е. Соловченко***, Г. В. Новикова*
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва **Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 21.05.2014 г.
Начиная с пионерской работы Salic и Mitchison (2008), активно расширяется применение аналога тимидина — 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) для выявления клеток, реплицирующих ДНК. После включения в ДНК этот нуклеозид можно обнаружить по флюоресценции после клик-реакции азид-алкинового циклоприсоединения с азидами флюорохромов. Недавно появились адаптированные для клеток растений протоколы применения EdU в сочетании с клик-реакцией для мониторинга S-периода клеточного цикла в меристемах корней и культивируемых in vitro клетках с использованием микроскопии и проточной цитометрии. В данной работе мы уделили внимание некоторым деталям имеющихся методов и их модификациям, а также рекомендовали новые протоколы. В частности, предложили сочетать включение EdU в клетки, реплицирующие ДНК, с последующим выделением протопластов и их подготовкой для микроскопического анализа и проточной цитометрии. Кроме того, предложен метод определения динамики фосфорилирования EdU в клетках in vivo.
Ключевые слова: Arabidopsis thaliana — Chlamydomonas reinhardtii — Synechocystis — Vigna radiata — клеточный цикл — культура клеток — нуклеотиды — S-период — протопласты — проточная цитометрия — тимидинкиназа — флуоресцентная микроскопия
DOI: 10.7868/S0015330314060141
ВВЕДЕНИЕ
В клеточном цикле (КЦ) можно выделить два определяющих этапа. Один из них — митоз, во время которого происходят заметные структурные изменения, вызванные равным распределением между дочерними клетками ядерной ДНК, упакованной в хромосомы. Название "хромосома" связано со способностью этих структур интенсивно окрашиваться цитологическими красителями, что вкупе с их достаточно крупными раз-
Сокращения: ДМСО — диметилсульфоксид; ДППЦ — двух-параметрическая проточная цитометрия; дТ — тимидин; КЦ — клеточный цикл; ТК — тимидинкиназа; 7-AAD — 7-аминоактиномицин D; BrdU — 5-бром-2'-дезоксиуридин; DAPI — 4',6-диамидино-2-фенилиндол; EdU — 5-этинил-2'-дезоксиуридин; MMC — митрамицин A; PBS — фосфатно-солевой буфер; PI — пропидиум йодид.
Адрес для корреспонденции: Носов Александр Владимирович. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: +7 (499) 977-80-18; электронная почта: alexv.nosov@mail.ru
мерами уже долгое время определяет плодотворность исследований хромосом, в первую очередь различными микроскопическими методами. Второй важный и масштабный процесс — репликация ДНК, проходящий без видимых структурных изменений. Именно этот этап связывает воедино периоды КЦ и определяет успешность непрерывной передачи идентичной наследственной информации в ряду поколений.
Безусловно, что возможность оперативной визуализации клеток, находящихся в периоде репликации ядерной ДНК (8-периоде/8-фазе КЦ), важна для различных областей биологии и физиологии клетки, в том числе при изучении регуляции КЦ, в исследованиях ответа клеток на стрессорные факторы, в скрининге ингибиторов репликации ДНК и т.д.
Известно, что клетка требует сбалансированного снабжения всеми четырьмя дезоксирибону-
клеозидтрифосфатами — непосредственными предшественниками синтеза ДНК [1]. Тимин — уникальное для ДНК азотистое основание, поэтому его нуклеотиды вовлекаются в построение только этой макромолекулы, но использование каким-либо способом маркированного дТТФ для выявления синтеза ДНК в живых клетках, в том числе клетках растений, затруднительно из-за плохой проницаемости плазмалеммы для нуклео-зидфосфатов. Однако нуклеозиды, в том числе тимидин (дТ), легко попадают в клетку с помощью соответствующих транспортеров [2]. Поступив в клетку, дТ фосфорилируется специфической тимидинкиназой (ТК; КФ 2.7.1.21) либо дезоксирибонуклеозидкиназой (КФ 2.7.1.145) с образованием дТМФ и далее в процессе последовательных киназных реакций образуется дТТФ — субстрат для ДНК-полимеразной реакции.
Классический метод выявления клеток, находящихся в 8-периоде, связан с использованием меченного тритием тимидина с последующей радиоавтографической детекцией включившегося в ДНК предшественника [3]. Этот метод активно применялся в течение полувека, и на его счету основные открытия в клеточной кинетике и исследованиях КЦ. Тем не менее, радиоавтографическая детекция включившегося в ДНК предшественника достаточно трудоемка и занимает продолжительное время (до нескольких недель экспозиции препаратов под фотоэмульсией). Кроме того, было желание заменить радиоактивный нуклеозид более безопасными соединениями. На помощь пришли 5-галоид-замещенные аналоги дТ, такие как 5-бром-2'-дезоксиуридин (Бгёи) и 5-йод-2'-дезоксиуридин. Аналоги дТ, как правило, легко транспортируются в клетку и вовлекаются в метаболизм дезоксирибонуклео-зидкиназами и/или ТК. После включения аналогов дТ в ДНК их выявляют с помощью специфичных моноклональных антител. Метод занимает значительно меньше времени, чем радиоавтография, но имеет следующие недостатки: (1) требуется денатурация ДНК (соляной кислотой, форма-мидом, нагреванием и т.п.) для взаимодействия эпитопов 5-галоид-замещенных аналогов дТ с антителами, что нарушает структуру ДНК и антигенные свойства ядра и клетки; (2) антитела плохо проникают в объемные образцы, и особое препятствие для антител создает клеточная стенка растений, которую необходимо разрушать [4—6].
В последние годы было предложено [4] и активно расширяется применение аналога дТ — 5-этинил-2'-дезоксиуридина (Бёи) — для выявления клеток, реплицирующих ДНК. После включения в ДНК этот предшественник легко обнаруживается в клик-реакции (реакции, пред-
назначенной для быстрого и надежного получения новых молекул путем соединения отдельных элементов) азид-алкинового циклоприсоедине-ния, катализируемой Cu(I), впервые описанной в 2002 г. в работах двух независимых групп экспериментаторов [7, 8]. Терминальная алкиновая группа EdU реагирует с азидами флюорохромов (например с азидом Alexa Fluor 488), формируя стабильные ковалентные связи. Этот метод не требует жесткой денатурации ДНК, разрушения клеточной стенки, дополнительной пермеабили-зации плазмалеммы и ядерной мембраны и позволяет сократить время процедуры выявления клеток, реплицирующих ДНК, по крайней мере, в три раза по сравнению с протоколом, использующим BrdU и иммунодетекцию [4—6].
После работы Vanstraelen с соавт. [9], в которой применяли 24-часовую экспозицию корней Ara-bidopsis с EdU для выяснения роли гена CCS52A2 в функционировании покоящегося центра меристемы корня, в 2010 г. появилась первая подробная статья Kotogany с соавт. [5] о методах использования EdU в сочетании с клик-реакцией для мониторинга S-периода КЦ в меристемах корней и культивируемых in vitro клетках с применением микроскопии и проточной цитометрии. В обзоре 2014 г. [10] были кратко проанализированы имеющиеся к настоящему времени 20 публикаций, в которых репликацию ДНК в клетках и тканях растений выявляли с помощью EdU с последующей клик-реакцией с азидами флюорохромов. Большинство работ было посвящено анализу доли S-фазных клеток в различных тканях; изменению репликации ДНК в мутантных и трансгенных растениях; характеристике "образа" репликации на уровне хромосом и хроматина.
Безусловно, практика использования EdU в экспериментальной биологии растений будет расширяться. В связи с этим в настоящем исследовании мы сосредоточили внимание на методических деталях имеющихся и модифицированных протоколов, а также попытались дополнить возможные области применения EdU в клик-реакции с азидами флюорохромов для физиологии и биохимии клеток растений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования. Суспензионные культуры клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. двух генотипов: дикого типа Col-0 (экотип Columbia) и мутанта ein2-1 (EIN2 — один из компонентов пути передачи сигнала этилена), были получены из каллусов листового происхождения. Культуры клеток выращивали в среде Schenk и Hildebrandt (SH) [11] с 3% сахарозы, 1 мг/л 2,4-Д и 0.1 мг/л ки-
нетина в стеклянных колбах в темноте при температуре 26°С и постоянном перемешивании (120 качаний/мин). Период субкультивирования— 10 дней. Семена растений Col-0 [N1092] и ein2-1 [N3071] были предоставлены Nottingham Arabi-dopsis Stock Centre (NASC, Великобритания).
Штамм Synechocystis sp. PCC 6803 GT был любезно предоставлен Dr. N. Murata (National Institute for Basic Biology, Okazaki, Япония). Его выращивали на среде BG11 [12], в которую добавляли необходимое количество 20 мМ Hepes-NaOH до pH 7.6. Штамм Chlamydomonas reinhardtii 137С+ IPPAS L-1014 выращивали на среде TAP [13]. Культивировали водоросли в 300-миллилитровых колбах в 80 мл среды при температуре 25°С, постоянном перемешивании (70 качаний/мин) и постоянном освещении люминесцентными лампами интенсивностью 35 мкмоль фотонов/(м2 с).
Семена Vigna radiata L. сорта Berken промывали, замачивали в теплой воде на 1 ч, снимали семенную кожуру и проращивали в течение суток в темноте при 25°С в ячейках 12-луночной плашки в небольшом объеме воды, покрывавшем не более половины семени.
Инкубация с EdU и фиксация клеток и тканей. В логарифмической фазе роста (3-5-е сутки) отбирали аликвоты суспензионных культур клеток Arabidopsis и добавляли 10—20 мкМ EdU ("Invitro-gen", кат. № A10044) из 10 мМ раствора в диме-тилсульфоксиде (ДМСО). Клетки инкубировали при 26°С на шейкере (120 качаний/мин): для выявления S-фазных клеток — в течение 30— 120 мин, для определения пула клеток, способных к репликации ДНК, — в течение 2—3 суток. Клетки водорослей и цианобактерий отбирали на третьи сутки культивирования и инкубировали
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.