БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 2, с. 355-359
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ =
УДК 577.3
ДОСТАВКА ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА
В ЛЕГКИЕ ЖИВОТНЫХ
© 2015 г. Г.Н. Можокина, Н.А. Елистратова, В.Д. Микоян*, А.Ф. Ванин*
Научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии, Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, 127994, Москва, ул. Достоевского, 4; *Институт xимической физики им. Н.Н. Семёнова РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина, 4
E-mail: уапт@ро1утег.скрН.ras.ru Поступила в p едакцию 20.01.15 г.
П родемонстрировано эффективное накопление биядерных динитрозильных комплексов железа с глутатионом в ткани легкого при подкожном паралимфатическом введении этих комплексов в водном растворе в разовой дозе 2 мкмоль/кг дважды в сутки с перерывом в 2 ч. Через 2 ч после повторного введения концентрация этих комплексов достигала 16 мкмолей/кг ткани, снижаясь за последние 2 ч до 7 мкмолей/кг ткани. При однократном введении биядерных динитрозильных комплексов железа с глутатионом концентрация их через 2 и 4 ч была в два раза ниже, чем в предыдущих опытах. Возможно, при полученных концентрациях динитрозильных комплексов железа в легких будет наблюдаться бактерицидный эффект в отношении микобактерий туберкулеза и в отношении быстропролиферирующих опухолей легких.
Ключевые слова: динитрозильные комплексы железа, кожные раны, монооксид азота.
Низкомолекулярные динитрозильные комплексы железа (соответственно М - и Б-ДНКЖ) с тиолсодержащими (ИБ) лигандами в виде их моно- и биядерной форм (формулы соответственно [(И8)2Ре^0)2] и [(ИБ)2Ре2^ 0)4]), выступающие в организме животных и человека в качестве доноров одного из универсальных регуляторов метаболических процессов - монооксида азота (N0), способны оказывать на животных и человека разнообразное биологическое действие - как регулято рное, так и цито-токсическое [1,2]. В организме животных и человека в результате пер ехода Бе^0)2 фрагментов из низкомолекулярных М- и Б-ДНКЖ на тиоловые группы белков в белок-связанные ДНКЖ подавляющая часть низкомолекулярных Б-ДНКЖ превращается в более стабильные белок-связанные ДНКЖ [3,4]. Последние, как депо N0, обеспечивают существование в течение сравнительно длительного времени находящихся с ними в химическом равновесии низкомолекулярных ДНКЖ, которые, как высокоподвижные соединения, и оказывают на о рганизм животных и человека указанное биологическое действие.
Сокращения: М - и Б-ДНКЖ - моно- и биядерные динитрозильные комплексы железа, RS - тиолсодержащие ли-ганды, Глт, GS - глутатион.
Регуляторный характер этого воздействия определяется способностью низкомолекулярных ДНКЖ передавать молекулы монооксида азота и ионы нитр озония (N0+) на мишени их биологического действия - соответственно ге-мовые и тиоловые группы белков. Этот перено с лежит в основе вазодилаторного и гипотензивного действия ДНКЖ [5,6], их способности подавлять агрегацию тромбоцитов [7], ускорять заживление кожных ран [8]. Цитотоксическая активность ДНКЖ проявляется при быстром распаде этих комплексов, вызванном действием на них различных экзогенных или эндогенных хелаторов железа [1,2,9]. Высвобождающиеся при этом молекулы N0 окисляются в реакции с супероксидом до пероксинитрита, который и оказывает токсическое действие на клетки и ткани [10]. Цитотоксический эффект ДНКЖ продемонстрирован в отношении р азвития эн-дометриоидных опухолей на модели эндомет-риоза у крыс [11,12] и в отношении культуры злокачественных клеток 1игка1 [13]. В исследованиях [14,15] показано, что взаимодействие N0 с важными регулято рными белками мико-бактерий туберкулеза - железо-серными белками WhiB - пр иводит к образованию белок-связанных ДНКЖ, что приводит к изменению про -лиферативной активности микобактерий.
Монооксид азота и его производные, про -дуцируемые иммуннокомпетентными клетками,
355
10*
как бактер ицидные агенты могут обеспечивать защиту от туберкулезной инфекции. На моделях туберкулеза у мышей было показано, что про -грессирование тубер кулезного поражения внутренних органов зависит от уровня N0 [16]. Под влиянием избытка N0 микобактерии переходили из стадии активной пролиферации в латентное, нерепликативное состояние, что приводило к резкому ослаблению патогенного действия микобактерий на ткани легких [17,18]. В опытах на культуре микобактерий туберкулеза использование соединений, доноров N0 - N0-атов или Б-нитрозотиолов (И8-К0), пр иводило к гибели микобактерий [19,20]. Однако в опытах на инфицированных животных, когда использовались высокие дозы этих соединений, последние вызывали гибель не только микобак-терий в тканях легких, но и самих этих тканей. Обусловлено это было самопроизвольным распадом N0-атов и И8-ГЧ0 не только в области локализации микобактерий, но и во всей ткани легкого [20].
В связи с этим, весьма целесообразным представляется разработка способов доставки ДНКЖ в организм животных с целью обеспечения цитотоксического действия этих комплексов на микобактерии туберкулеза и безопасных для макроорганизма. Ранее была изучена эффективность и безопасность ингаляционного пути введения ДНКЖ в организм мышей [21], при котором содержание белок-связанных ДНКЖ в легких уже через 2 ч после окончания ингаляции резко снижалось и не обеспечивало бактерицидного эффекта у инфицированных животных. При этом у большинства мышей был высокий риск развития гемоторакса после ингаляции.
В настоящей работе исследовано распределение белок-связанных ДНКЖ в крови, легких, печени, парааортальных и бифуркационных лимфатических узлах крыс при введении им ДНКЖ с глутатионом (Глт, в Б) подкожно в область паховых лимфатических узлов в зависимости от дозы и кратности введения. Оценка этого распределения проводилась методом ЭПР по интенсивности характерного для ЭПР-сиг-нала М-ДНКЖ при #ср = 2,03 [3].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали 2 мМ раствор пре-пар ата Б-ДНКЖ-Глт, полученный пятикратным разбавлением 10 мМ раствора этого комплекса, синтезированного согласно описанному ранее «простейшему» стандартному методу синтеза этого комплекса [22]. В основе этого метода лежит способность Б-нитрозоглутатиона (вБ-
N0) вступать в реакцию с ионами Ре2+ с образованием при участии глутатиона соответствующих М-ДНКЖ. При нейтральных значениях рН даже при наличии в среде значительного количества глутатиона М-ДНКЖ-Глт предпо-читает [23] переходить в Б-ДНКЖ-Глт по схеме:
2[(в Б-)2Ре+ ^ 0+)2] ^ [(в Б-)2Ре2+ (N0+)^ + 2в Б-.
В соответствии с [22], синтез 10 мМ раствора Б-ДНКЖ с глутатионом проводили следующим обр азом. К 10 мл дистиллированной воды на воздухе добавляли 248 мг глутатиона (80 мМ), вызывавшего подкисление раствора до 3,0, с последующим введением в него 112 мг (40 мМ) сернокислого железа, приводившего к дальнейшему снижению рН до 2,8. После этого в раствор добавляли 27,6 мг (40 мМ) нитр ита натр ия, что приводило к р озовому окрашиванию р ас-твора, обусловленному образованием Б-нитро -зоглутатиона (0Б-К0).
Судя по интенсивности оптического поглощения при длине волны 334 нм, характерного для 08-ГЧ0, реакция заканчивалась через 2 ч с образованием 40 мМ этого соединения. После этого рН раствора повышали до 7,2, что приводило к о ранжевому окрашиванию раствора, обусловленному начавшимся процессом образования Б-ДНКЖ в растворе. Для полного пр е-вращения 08-ГЧ0 в Б-ДНКЖ требовало сь несколько часов. После удаления образовавшегося за это время осадка гидроокиси трехвалентного железа полученный раствор с последующей модификацией (добавлением глутатиона, см. ниже) использовали в экспериментах на животных.
Оценку полученного количества Б-ДНКЖ с глутатионом (мол. вес 846 Да) проводили оптическим методом по интенсивности характерных для этого комплекса полос поглощения на 310 и 360 нм, характеризующихся коэффициентами экстинкции соответственно 9200 и 7400 М-1см-1 [23]. Согласно этой оценке, концентрация Б-ДНКЖ в р астворе составляла ~ 10 мМ или 20 мМ в пересчете на один атом железа в комплексе. Молярное отношение Б-ДНКЖ к свободному (несвязанному с Б -ДНКЖ) глутатиону в ра створе составляло 1:2. Далее в этом растворе растворяли 100 мМ глутатиона с последующим повышением рН до 7,4. В результате молярное отношение Б-ДНКЖ к свободному глутатиону снижалось до 1:12. Этот раствор Б-ДНКЖ-Глт (после пятикратного разбавления дистиллированной водой) использовали в опытах на животных.
Эксперименты проводили на крысах-самцах массой 250-300 г, разделенных на две группы. В пер вой группе животным вводили Б-ДНКЖ-
Глт в разовой дозе 2 мкмоль/кг однокр атно в подкожно -жир овую клетчатку в области пахо -вых лимфатических узлов (паралимфатически) с последующим забоем животных чер ез 2 и 4 ч после введения пр епар ата. Животным втор ой г р уппы Б-ДНКЖ -Глт вводили аналогичным способом в той же разовой дозе, но дважды в сутки (суточная доза 4 микр омоль/кг) с интервалом в 4 ч между введениями. Забой этих животных проводили также через 2 и 4 ч после втор ого введения. После забоя у кр ыс бр али кровь, печень, легкие, парааортальные и би-фур кационные лиматические узлы, котор ые помещали в цилиндрические ампулы диаметр ом 4 мм с последующим их замораживанием в жидком азоте. Перед ЭПР-измерениями замо-р оженные ткани извлекали из ампул и регист -р ир овали в них спектр ы ЭП Р пр и 77 К (или после р азмор аживания) пр и комнатной темпер атур е. Эти измер ения пр оводили на модифи-цир ованном р адиоспектр ометр е «Р адиопан» (Польша) пр и условиях, пр иведенных на р и-сунке. Оценку концентраций М-ДНКЖ, появляющихся в тканях кр ы с, пр оводили путем со -поставления амплитуды сигналов с g = 2,03 в этих тканях и сигнала ЭПР М-ДНКЖ с глу-татионом, полученного добавлением к синтезированному препарату Б-ДНКЖ 10-кратного избытка глутатиона с последующим повышением рН до 11. Эта процедура приводила к пр ев р ащению всего Б-ДНКЖ в М-ДНКЖ с концентр ацией по следнего, р авной 5 мМ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рисунке пр иведены спектр ы ЭП Р, зар е-гистр ир ованные пр и 77 К и комнатной температуре в крови, лимфатических узлах, печени и легких крыс после введения им подкожно в область паховых лим
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.