МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 1, с. 149-157
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 571.27
ДОЗОЗАВИСИМЫЕ ЭФФЕКТЫ ДЕКСАМЕТАЗОНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ Т-ЛИМФОЦИТОВ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
© 2015 г. А. А. Гуцол, Н. А. Сохоневич, К. А. Юрова, О. Г. Хазиахматова, В. В. Шуплецова, Л. С. Литвинова*
Инновационный парк, Балтийский федеральный университет им. Иммануила Канта, Калининград, 236016
Поступила в редакцию 25.04.2014 г. Принята к печати 10.06.2014 г.
Глюкокортикоиды — иммуносупрессивные и противовоспалительные агенты, которые оказывают плейотропное действие на рост, дифференцировку и функциональную активность Т-лимфоцитов. Проведена комплексная оценка влияния дексаметазона на функциональную активность Т-клеток разной степени дифференцировки в условиях in vitro. Установлено, что в целом дексаметазон угнетает функциональную активность Т-лимфоцитов CD45RA+ и CD45RO+. В популяции наивных (CD45RA+) Т-кле-ток более выражен подавляющий эффект дексаметазона на ранние (lL-2-зависимые, ассоциированные с экспрессией CD25 и продукцией lL-2) этапы активации, в то время как в культуре примированных клеток памяти (CD45RO+) дексаметазон действует на более поздних (IL-2-независимых, ассоциированных с экспрессией молекул пролиферации CD71) этапах. Разнонаправленные эффекты дексаметазона на уровень экспрессии мРНК гена каталитической единицы теломеразы (hTERT) ассоциированы со степенью дифференцировки Т-клеток. Возможно, роль глюкокортикоидных гормонов в иммуногенезе направлена прежде всего на сдерживание избыточного роста Т-клеток и на поддержание клонального баланса в лимфоидной ткани.
Ключевые слова: дексаметазон, наивные Т-лимфоциты, примированные Т-лимфоциты памяти, функциональная активность, жизнеспособность, CD25, CD71, IL-2, hTERT.
DOSE-DEPENDENT EFFECTS OF DEXAMETHASONE ON FUNCTIONAL ACTIVITY OF T-LYMPHO-CYTES DIFFERENT GRADE OF DIFFERENTIATION, by A. A. Gutsol, N. A. Sokhonevich, K. A. Yuro-va, O. G. Khaziakhmatova, V. V. Shupletsova, L. S. Litvinova* (Innovation Park, Immanuel Kant Baltic Federal University, Kaliningrad, 236000 Russia; *e-mail: larisalitvinova@yandex.ru). Glucocorticoids are antiinflammatory and immunosuppressive agents which have pleiotropic effects on growth, differentiation and functional activity of T-lymphocytes. Under experimental conditions in vitro carried out a comprehensive assessment of the dexamethasone influence on the functional activity of T-cells with different differentiation degrees. It was established that the influence of dexamethasone on the functional activity of CD45RA+ and CD45RO+ T-lymphocytes, in general, has depressing character. It was revealed that in the population of naive (CD45RA+) T cells dexamethasone exerts a more pronounced inhibitory effect on early (IL-2-dependent, associated with the CD25 expression and IL-2 production) activation stages, whereas in the culture primed memory cells (CD45RO+) — for later (IL-2-independent, associated with the expression of proliferation molecule CD71). Multidirectional effects of dexamethasone on the expression level of telomerase catalytic unit (hTERT) mRNA are associated with the degree of T cells differentiation. It is proposed, that the role of glucocorticoid hormones in immunogenesis is primarily aimed at suppression of excessive T cells growth and on the maintainance of the clonal balance in lymphoid tissue.
Keywords: dexamethasone, naive T-lymphocytes, primed memory T-lymphocytes functional activity, viability, CD25, CD71, IL-2, hTERT.
DOI: 10.7868/S0026898414060068
Принятые сокращения: Ac/Exp — реагент T-Cell Activation/Expansion Kit human (активатор Т-лимфоцитов); CD — кластер дифференцировки; IL-2 — интерлейкин-2; IL-2R — рецептор интерлейкина-2; hTERT (human telomerase reverse transcriptase) — каталитическая субъединица теломеразы человека.
* Эл. почта: larisalitvinova@yandex.ru
Глюкокортикоиды — стероидные гормоны, обладающие мощной иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью, которые оказывают плейотропное действие на рост, диф-ференцировку и функциональную активность лимфоцитов [1, 2]. Эффекты глюкокортикоидов проявляются через взаимодействие со специфическими рецепторами, которые представляют собой активируемые лигандом факторы транскрипции. Глюкокортикоидный рецептор относится к ядерным рецепторам, он находится преимущественно в цитоплазме, но в процессе активации ли-гандом транслоцируется в ядро [3]. Ядерные рецепторы регулируют экспрессию большого числа генов, активируя или подавляя их транскрипцию. К действию глюкокортикоидов чувствительны гены, контролирующие продукцию некоторых цитоки-нов, а также клеточный цикл, особенно G^S-пере-ход [4]. Вполне вероятно, что в зависимости от стадии развития клеток и состояния их активации воздействие глюкокортикоидов может определяться разными механизмами.
Анализ экспрессии поверхностных маркеров и структурно-функциональных свойств клеток позволяют выделять наивные и примированные Т-лимфоциты (клетки иммунной памяти) [5]. Селективная экспансия и дифференцировка клонов антигенспецифичных Т-клеток иммунной памяти определяют эффективность иммунного ответа на антигены различной природы [6—8]. Однозначным фенотипическим признаком диф-ференцировки наивных Т-лимфоцитов человека в Т-клетки памяти принято считать появление на их поверхности молекул CD45RO+ взамен изоформы CD45RA+ [9]. Ранее считалось, что зрелые меду-лярные тимоциты и периферические лимфоциты резистентны к глюкокортикоидам, однако не так давно показали, что определенные субпопуляции зрелых Т-лимфоцитов (эффекторные Т-клетки, NK-клетки) подвергаются апоптозу под действием глюкокортикоидов [10—12].
Цель нашей работы состояла в комплексной оценке дозозависимых эффектов дексаметазона на жизнеспособность и функциональную активность Т-лимфоцитов разной степени дифферен-цировки (наивных CD45RA+ и примированных CD45RO+).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалом исследования служила венозная кровь 22 условно здоровых доноров (16 мужчин и щесть женщин в возрасте от 19 до 39 лет).
Фракцию мононуклеарных клеток крови выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Urografin ("Schering" Испания; "Pharmacia" Швеция) (р = 1.077 г/см3). Популяции CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток полу-
чали путем иммуномагнитной сепарации с использованием технологии MACS® ("Miltenyi Bio-tec", Германия) согласно протоколу фирмы. Чистоту выделенных клеток определяли с помощью моноклональных антител, конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) или фикоэ-ритрином (PE) ("Abcam", Великобритания). Содержание фракции CD45RA+- и СЭ45ЯО+-клеток в образцах составляло не менее 95%.
Далее клетки (1 х 106/мл) культивировали в 48-луночном планшете в среде Искова ("Sigma", США), содержащей 5 х 10-5 M Р-меркаптоэтанол ("Acros Organics", США) и 30 мкг/мл гентамици-на, в присутствии разных концентраций дексаме-тазона ("KRKA", Словения) в течение 48 ч при 37°С во влажной атмосфере и 5% С02. Т-лимфоци-ты активировали с использованием реагента T-Cell Activation/Expansion Kit human (Ac/Exp) ("Miltenyi Biotec"), который представляет собой антибиоти-новые частицы с биотинилированными антителами против CD2+, CD3+, CD28+. Реагент Ac/Exp добавляли в пробы в количестве 5 мкл (0.5 х 106 антибио-тиновых частиц MACSiBead™). Соотношение клеток и активирующих частиц вставляло 1 : 2.
Отсутствие примесей моноцитов ^D14+) и В-лимфоцитов (CD19+) в культурах клеток CD45RA+ и CD45RO+ до и после культивирования подтверждали c помощью проточной цито-метрии с использованием моноклональных антител, конъюгированных с FITC, PE, PE-Cy7 и PerCP ("Abcam", "e-Bioscience", США). В работе использовали клеточные культуры, в которых содержание CD3+CD45RA+CD14CD19- и CD3+CD45RO+CD14CD19- клеток составляло в среднем 97.5 ± 2.12%.
Количество клеток CD45RA+ и CD45RO+, экс-прессирующих молекулы CD25 и CD71, определяли методом проточной цитофлуориметрии с использованием моноклональных антител, конъ-югированных с FITC, PE, PE-Cy7 и APC ("Abcam", "e-Bioscience").
Анализ поверхностных маркеров проводили на проточном цитофлуориметре MACS Quant ("Miltenyi Biotec") согласно протоколу фирмы-производителя.
Количество живых и мертвых лимфоцитов CD45RA+ и CD45RO+ определяли методом проточной цитофлуориметрии на аппарате Guava Easy Cyte Plus ("Millipore", США) с использованием реагента и программы Guava Via Count ("Millipore").
Содержание IL-2 в культуральных супернатан-тах определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем ("Вектор-Бест", Россия) и автоматизированного иммуноферментного планшетного анализатора Microplates reader Model 680 ("BioRad", США).
Статистический анализ проводили с использованием программного пакета Statistica 7.0. Рассчитывали среднее арифметическое значение (М) и стандартное отклонение (а). Статистическую значимость различий оценивали с использованием U-критерия Манна—Уитни. Различия считали значимыми прир < 0.05 (р0 — статистическая значимость отличий от интактной пробы; р1 — по сравнению с пробой с добавлением активатора Ac/Exp).
После инкубации клеточных культур суммарную РНК выделяли с использованием водного раствора фенола и гуанидинизотиоцианата (Ex-tractRNA kit "Евроген", Россия) согласно протоколу производителя. Концентрацию РНК измеряли с помощью спектрофотометра Nano Vue Plus ("GE Healthcare", США). Степень очистки препаратов РНК определяли по соотношению А260/А280. Концентрацию образцов РНК приводили к одному значению для получения одинаковых количеств кДНК. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора реагентов MMLV RT kit ("Евроген", Россия) согласно протоколу производителя и олигонуклеотидного праймера (oligo(dT), 20 мкМ) в качестве затравки ("Евроген", Россия).
Относительный уровень экспрессии hTERT определяли методом ПЦР в режиме реального времени с использованием специфических гид-ролизуемых проб. ПЦР проводили с применением реагентов qPCRmixHS ("Евроген", Россия). Концентрация праймеров — 900 нМ, гидролизуе-мых проб — 250 нМ. В качестве референсного использовали ген RPLPO, кодирующий р
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.