научная статья по теме ДОЗОЗАВИСИМЫЙ ЭФФЕКТ НОКОДАЗОЛА НА ЦИТОСКЕЛЕТ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Биология

Текст научной статьи на тему «ДОЗОЗАВИСИМЫЙ ЭФФЕКТ НОКОДАЗОЛА НА ЦИТОСКЕЛЕТ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 3, с. 181-190

УДК 576.311.348.7:576.311.346.2

ДОЗОЗАВИСИМЫЙ ЭФФЕКТ НОКОДАЗОЛА НА ЦИТОСКЕЛЕТ

ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК

© 2008 г. К. М. Смурова, А. А. Бирюкова*, А. Д. Верин**, И. Б. Алиева

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. АН. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; электронная почта:

irina_alieva@belozersky.msu.ru *Медицинский факультет, отдел пульмонологии и неотложной медицины, Университет Чикаго, США **Центр сосудистой биологии, Медицинский Колледж Джорджии, Агаста, Джорджия, США

Поступила в редакцию 09.10.2007 г.

Эндотелий, выстилающий внутреннюю поверхность сосудов, выполняет барьерную функцию - регулирует проницаемость сосудистой стенки, обеспечивая обмен между циркулирующей в сосудах кровью и тканевой жидкостью. Нарушение нормальной функции (дисфункция) эндотелия связано с последовательной перестройкой цитоскелета клеток, активацией актомиозинового сокращения и, как следствие, образованием промежутков между эндотелиальными клетками. Микротрубочки являются первым эффекторным звеном в цепи реакций, приводящих к барьерной дисфункции. Дисфункция эндотелия приводит к повышению проницаемости сосудистой стенки, наблюдаемой при многих заболеваниях человека, а также является побочным эффектом лечения онкологических заболеваний препаратами, блокирующими митоз. В работе предполагалось выяснить, можно ли предотвратить побочные эффекты митостатических агентов, связанные с дисфункцией эндотелия, подобрав концентрацию митостатического агента, воздействующую на микротрубочки, но не вызывающую барьерной дисфункции эндотелия. Популяция микротрубочек в клетках эндотелия неоднородна: наряду с динамичными микротрубочками в цитоплазме присутствуют и модифицированные посттрансляционно микротрубочки - менее динамичные и более стабильные в отношении внешних воздействиий. Оказалось, что в клетках эндотелия область, занимаемая стабильными микротрубочками, весьма значительна (около трети от всей клетки), что, как мы предположили, повышает устойчивость системы микротрубочек эндотели-ального монослоя к воздействиям, приводящим к барьерной дисфункции. В настоящей работе данное предположение проверяли, используя в качестве индуктора дисфункции эндотелия нокодазол. Эффект нокодазола на цитоскелет эндотелиальных клеток является дозозависимым - использование нокода-зола в микромолярных концентрациях приводит к необратимым нарушениям не только барьерной функции, но и жизнедеятельности клеток, вплоть до их гибели. В наномолярных концентрациях нокодазол также вызывает увеличение проницаемости эндотелиального монослоя, однако в интервале 100-200 нМ этот процесс обратим. Нокодазол в концентрации 100 нМ вызывает частичное разрушение микротрубочек на краю клетки, но не оказывает существенного влияния на количество ацетили-рованных микротрубочек и актиновых филаментов. Повышение концентрации до 200 нМ приводит к значительному разрушению системы динамичных, но не ацетилированных микротрубочек, а также к увеличению содержания актиновых филаментов в центральном районе клетки. Таким образом, разрушение периферических микротрубочек запускает каскад реакций, приводящих к барьерной дисфункции эндотелия, но наличие значительного количества стабильных микротрубочек, устойчивых к наномолярным концентрациям нокодазола, позволяет клетке не только сохранить жизнеспособность, но и восстановить функциональную активность.

Эндотелий - пласт клеток, выстилающий внутреннюю поверхность сосудов - выполняет в организме специфическую барьерную функцию: он регулирует проницаемость стенки сосуда, обеспечивая обмен между циркулирующей в сосудах кровью и тканевой жидкостью. Выполнение этой функции обеспечивает цитоскелет, создающий сокращающие и растягивающие эндотелиальную клетку силы, в норме находящиеся в равновесии [1-5]. Нарушение барьерной функции - дисфункция эндотелия - характеризуется значительной перестройкой цитоскелета клеток, ее адгезивных структур, активацией актомиозинового сокращения. Такая реор-

ганизация цитоскелетных структур при барьерной дисфункции приводит к изменению формы клетки, образованию межклеточных промежутков и является структурной основой повышения сосудистой проницаемости, что характерно для многих заболеваний человека [2, 6-9].

В организме человека дисфункция может быть вызвана физиологическими факторами. Так, тромбин, образующийся на поверхности поврежденных клеток из циркулирующего в крови протромбина и вызывающий коагуляцию крови, способен нарушать барьерную функцию эндотелия [3, 4]. Как показали наши предыдущие исследования, выпол-

ненные на модели эндотелиального монослоя, реакция актиновых филаментов, а также изменение площади эндотелиальных клеток развивались позднее, чем нарушения в структуре сети микротрубочек. Таким образом, мы предположили, что именно реакция микротрубочек является первым этапом барьерной дисфункции, вызванной действием тромбина, а сами микротрубочки - это первое эффекторное звено в цепи перестроек фибриллярного цитоскелета эндотелиальной клетки [4, 10, 11].

Барьерная дисфункция эндотелия возникает также и под воздействием внешних факторов. Собственно, первоначальной мотивацией к данной работе послужил тот факт, что в клинической практике при лечении онкологических больных препаратами, вызывающими деполимеризацию микротрубочек (винка-алкалоиды), наблюдались случаи развития острой дыхательной недостаточности и отека легкого [12, 13]. Это свидетельствует о повреждении эндотелиального барьера в сосудах легких веществами, обладающими митостатическим эффектом. Митостатики этого типа давно и широко применяются для ограничения роста трансформированных опухолевых клеток - они нарушают деление клеток опухоли в результате воздействия на митотический аппарат и разрушения микротрубочек митотического веретена (менее устойчивых, чем интерфазные) [14-17]. Считается, что опухолевые клетки более подвержены действию митостатиков, т.е. для блокирования их деления необходимы меньшие дозы вещества, чем для остановки митоза в нормальных клетках. Однако очевидно, что полностью исключить воздействие винка-алкалоидов на клетки здоровых тканей невозможно, эти клетки в той или иной степени также подвержены поражению. Поскольку микротрубочки являются основной мишенью митостатиков, можно предположить, что отек легкого, обусловленный барьерной дисфункцией, вызван разрушением системы микротрубочек в клетках эндотелия и цепью дальнейших клеточных реакций. В наших предыдущих исследованиях мы выяснили, что действие нокодазола является дозозависимым [5] и существует интервал концентраций, которые не препятствуют последующему восстановлению эндотелиального барьера до физиологической нормы. Цель настоящей работы - выяснить, можно ли предотвратить появление побочных эффектов мито-статических агентов, связанных с дисфункцией эндотелия, подобрав концентрацию митостатиче-ского агента, с одной стороны, воздействующую на микротрубочки, а с другой - не вызывающую барьерной дисфункции эндотелия.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культура клеток. Культура клеток эндотелия легочной артерии человека (НРАЕС) получена из

компании "Clonetics BioWhittaker Inc." (США). Клетки выращивали на среде EGM-2 ("Clonetics BioWhittaker Inc.") при 37°С и 5% CO2. Для экспериментов использовали клетки 6-10 пассажей.

Экспериментальные воздействия. Клетки обрабатывали нокодазолом ("Sigma", США) в концентрации 100 и 200 нМ в течение 30 мин. Концентрированный 10 мМ раствор нокодазола готовили на диметилсульфоксиде (DMSO). Конечная концентрация DMSO в среде не превышала 0.1% (по объему).

Иммунофлуоресцентное окрашивание. Для им-

мунофлуоресцентного окрашивания клетки фиксировали 1.5% раствором глутарового альдегида ("Sigma", США) на физиологическом фосфатном буфере (PBS), pH 6.8 ("Sigma", США) в течение 10 мин и отмывали трехкратной сменой PBS (по 10 мин каждая). Фиксированные клетки пермеаби-лизовали 0.1% раствором Triton X-100 ("Sigma", США) на PBS в течение 15 мин с последующей отмывкой PBS (3 раза по 10 мин). Для устранения фонового свечения перед окраской антителами клетки обрабатывали 0.2% раствором боргидрида натрия NaBH4 ("Sigma", США) на PB S (3 раза по 10 мин) и отмывали буфером PBS (3 раза по 10 мин).

Далее клетки инкубировали с первичными (30 мин, 37°С), а затем вторичными антителами (30 мин, 37°С).

Для окраски микротрубочек в качестве первичных антител использовали моноклональные мышиные антитела к Р-тубулину ("ICN", США) (разведение 1 : 200), моноклональные мышиные антитела к ацетилированному тубулину ("Accurate Chemicals", США) (разведение 1 : 100), моноклональные мышиные антитела к тирозилированно-му тубулину ("ICN", США) (разведение 1 : 100).

В качестве вторичных антител использовали антимышиные антитела, конъюгированные с флуоресцентными красителями Alexa -488 или Alexa -594 ("Molecular Probes", США) (разведение 1 : 100).

Актиновые филаменты окрашивали при помощи фаллоидина, конъюгированного с флуорохро-мом Texas Red ("Molecular Probes", США) (разведение 1 : 200).

Покровные стекла монтировали на предметные, используя в качестве заливочной среды смесь воды и глицерина (1 : 1). Для сохранности образцов края покровных стекол заливали лаком.

Получение и обработка цифровым изображений. Иммунофлуоресцентно окрашенные препараты эндотелиального монослоя изучали с использованием микроскопа Nikon Eclipse TE2000 с объективом 60/1.4 ("Nikon Intech Co.", Япония). Для наглядности выбирали наиболее распластанные, краевые, клетки. Изображения записывали на цифровую охлаждаемую ПЗС-камеру Hamamatsu

Рис. 1. Для оценки количества стресс-фибрилл на исходных изображениях клеток (левое фото - актиновые филаменты окрашены фаллоидином, конъюгированным с флуорохромом Texas Red) выделяли область, соответствующую полиме-ризованному актину (правое фото - полимеризованный актин выделен серым цветом; учитывали все участки, превышающие по интенсивности средний уровень фона в клетке в 2 и более раз) и находили отношение их площади к площади всей клетки. Для оце

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком