МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2009, том 43, № 4, с. 761-765
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 575:599.9
ДВА CpG-OCTPOBKA ГЕНА SEMA3B: МЕТИЛИРОВАНИЕ ПРИ СВЕТЛОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ПОЧКИ
© 2009 г. В. И. Логинов1*, Д. С. Ходырев1, И. В. Пронина1' 2, А. В. Малшкова1' 3, Т. П. Казубская4, В. Д. Ермилова4, Р. Ф. Гарькавцева4, Е. Р. Забаровский2, 3, Э. А. Брага1*
Государственный научный центр "ГосНИИгенетика", Москва, 117545 2Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991
3Microbiology, Cell Biology and Tumor Biology Center, Karolinska Institute, Stockholm, 17177 Sweden 4Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук,
Москва, 115478 Поступила в редакцию 24.10.2008 г.
Принята к печати 29.12.2008 г.
Ранее в линиях клеток мелкоклеточного (SCLC) и немелкоклеточного (NSCLC) рака легкого наблюдали метилирование CpG-островка в области гена SEMA3B (3p21.31). Согласно данным NCBI (Build 36) эта область соответствует первому интрону гена. В представленной работе изучено метилирование двух CpG-островков гена SEMA3B - промоторного и интронного - при светлоклеточном почечноклеточном раке (RCC). С применением метилспецифичной полимеразной цепной реакции и бисульфитного секве-нирования впервые показано метилирование с высокой частотой промоторного CpG-островка гена SEMA3B при RCC - 56% (34/61) и интронного - 35% (17/48). Установлена достоверная обратная корреляция между снижением содержания мРНК этого гена при RCC и метилированием промоторного CpG-островка (P < 0.05 по Фишеру). В случае интронного островка такая корреляция не выявлена. Этот результат позволяет предположить, что метилирование промоторного CpG-островка участвует в инактивации гена-супрессора SEMA3B при RCC.
Ключевые слова: хромосома 3, ген SEMA3B, CpG-островки, промоторная область, метилирование ДНК, уровень мРНК, светлоклеточный почечноклеточный рак.
TWO CpG-ISLANDS OF SEMA3B GENE: METHYLATION IN CLEAR CELL RENAL CELL CARCINOMA, by W. I. Loginov1, D. S. Khodyrev1, I. V. Pronina1, 2, A. V. Malyukova1' 3, T. P. Kazubskaya4, V. D. Ermilova4, R. F. Garkavtseva4, E. R. Zabarovsky2'3, E. A. Braga1* (1State Research Center "GosNI-Igenetika", Moscow, 117545 Russia; *е-mail: loginov7@genetika.ru; ebraga@genetika.ru; 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; 3Microbiology, Cell Biology and Tumour Biology Centre, Karolinska Institute, Stockholm, 17177 Sweden; 4Blokhin Cancer Research Centre, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 115478 Russia). Earlier in some small cell lung (SCLC) and non-small cell lung carcinoma (NSCLC) cell lines, methylation of CpG-island was found in the SEMA3B region, which belongs to the first intron according to the NCBI data base (Build 36). The aim of this work was to study methylation of two SEMA3B CpG-islands: promoter and intronic in clear cell renal cell carcinoma (RCC). Using methyl specific PCR and bisulfite sequencing, it was shown for the first time that promoter CpG-island was methylated in RCC with high frequency 56% (34/61), and intronic CpG-island - with somewhat lower frequency 35% (17/48). Significant reverse correlation was estimated between mRNA level decrease and methylation of promoter CpG-island in RCC for the first time (P < 0.05 by Fisher's exact test), no correlation was determined for intronic CpG-island. This result suggested that methylation of promoter CpG-island contributed into inactiva-tion of SEMA3B gene-suppressor in RCC.
Key words: chromosome 3, SEMA3B gene, CpG-islands, promoter region, DNA methylation, mRNA level, clear cell renal cell carcinoma.
Принятые сокращения: МСП - метилспецифичная ПЦР, выполняемая на ДНК, модифицированной бисульфитом натрия; NSCLC (Non-Small Cell Lung Carcinoma) - немелкоклеточный рак легкого; ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция на кДНК, полученной с помощью обратной транскрипции РНК; RCC (Renal Cell Carcinoma) - (здесъ) светлоклеточный почечноклеточный рак; SCLC (Small Cell Lung Carcinoma) - мелкоклеточный рак легкого.
* Эл. почта: loginov7@genetika.ru; ebraga@genetika.ru
Функции гена SEMA3B (3p21.3) разнообразны и связаны с подавлением онкогенеза. Ген SEMA3B может подавлять рост клеточной линии рака легкого NCI-H1299 и образование опухолей у мышей с иммунодефицитом [1, 2]. Белок Sema3B способен ингиби-ровать активацию онкобелков MET и RON, индуцировать апоптоз и подавлять неоангиогенез в опухолях (см. обзор [3]). Во многих линиях клеток мелкоклеточного (SCLC) и немелкоклеточного (NSCLC) рака легкого, а также в существенной доле первичных опухолей NSCLC отмечено снижение уровня мРНК гена SEMA3B (3p21.3) [1, 4]. Кроме того, показано метилирование CpG-островка в про-моторной области гена SEMA3B при раке легкого [1, 4, 5]. Эта область, как выяснилось позднее, соответствует первому интрону гена SEMA3B (NCBI Build 36). В то же время в промоторной области локализован протяженный CpG-островок с более высокой плотностью CpG, способный к связыванию ряда факторов транскрипции, содержащих участки взаимодействия с CpG-динуклеотидами (NCBI Build 36). В связи с этим представлялось целесообразным изучить метилирование двух CpG-островков и сравнить степень их участия в инактивации гена SEMA3B при светлоклеточном почечно-клеточном раке (RCC). Следует отметить, что нами недавно показано снижение (в 5-1000 раз) количества мРНК гена SEMA3B при RCC и с более высокой частотой (49%), чем при раке молочной железы, толстой кишки, яичников и NSCLC [6].
В представленной работе мы использовали восемь клеточных линий RCC (KH 39, Caki 1, Caki 2, TK 164, TK 10, HN 51, ACHN, KRC/Y). Образцы первичных опухолей RCC собраны и клинически охарактеризованы в РОНЦ РАМН. Мы анализировали парные образцы опухоли и гистологически нормальной ткани от 61 больного с RCC. Принципы отбора образцов, выделение высокомолекулярной ДНК и
суммарной РНК из нормальных и опухолевых тканей и культур клеток, синтез кДНК на суммарной РНК, условия проведения полуколичественной ОТ-ПЦР, обработка данных ОТ-ПЦР с помощью программы ^Тгап приведены в [6, 7].
Условия бисульфитной модификации ДНК описаны ранее [8]. Праймеры и условия ПЦР для би-сульфитного секвенирования промоторного района гена БЕМАЗБ приведены в таблице. Бисульфитное секвенирование проводили без предварительного клонирования продуктов ПЦР. Сопоставление ожидаемой и экспериментально определенной нуклео-тидной последовательности фрагмента гена БЕМАЗБ указывало на полноту бисульфитной конверсии. Метилирование промоторного района гена БЕМАЗБ анализировали также с помощью метил-специфичной ПЦР (МСП) [9]. ПЦР проводили в 2550 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-НС1, рН 8.8; 16.6 мМ (Ш4)2804; 0.01% твин-20; 0.25 мМ каждого dNTP; 5-50 нг модифицированной ДНК; 25 пмолей каждого праймера; 0.5 ед. акт. Но1-Taq-полимеразы ("СибЭнзим", Россия); MgQ2 в концентрации 2-3 мМ. Амплификацию проводили по следующей программе: 95°С, 5 мин; 34 цикла {95°С, 30 с; Тотж 25 с; 72°С, 30 с}; 72°С, 7 мин. Праймеры и условия ПЦР для МСП приведены в таблице. В качестве позитивного контроля 100%-ного метилирования использовали препараты ДНК плаценты, обработанные ДНК-метилтрансферазой 8881 ("СибЭнзим"). Образцы ДНК из лимфоцитов крови здоровых доноров использовали в качестве контроля для неметилированных аллелей.
На рис. 1 показана структурная организация гена БЕМАЗБ, включая расположение промоторного (1-го) и интронного (2-го) Срв-островков. Примеры анализа метилирования промоторного островка двумя методами показаны на рис. 2а. Методом би-сульфитного секвенирования определяли профиль
Маркеры для МСП и бисульфитного секвенирования
Маркер Структура праймеров 7^°C/Mg, мM Продукт ПЦР, п. н.
SEMA3B-M_1 CCACTCCCGCCTAACTACCG ATCGTTCGTCGTGTCGTAAAGT 53.5/3.0 91
SEMA3B-Um_1 ACTCCCACCTAACTACCAT ATTGTTTGTTGTGTTGTAA 45.5/2.0 90
SEMA3B-M_2 TGGTTAGGCGGGGTATTTTC TCAACAATAAAAACGAAAACG 58/3.0 133
SEMA3B-Um_2 GTGGTTAGGTGGGGTATTTTT ATCAACAATAAAAACAAAAACA 58/3.0 135
SEMA3B-Bs_seq CCCCCACTCAATAATTCCCTTT ATTTTGGGGTTGTTGGGGATT 62/2.0 330
Примечание. Приведены праймеры и условия ПЦР для анализа методом МСП первого (8ЕМА3Б-М_1 и 8ЕМЛ3Б-иш_1) и второго СрО-островков (8ЕМЛ3Б-М_2 и 8ЕМЛ3Б-иш_2), а также условия анализа первого островка с помощью бисульфитного секвенирования (8ЕМА3В-Б$_$ед).
РНК-ÎATA полимераза бокс ^ II '
3'
3 4 5 6 7 8 9-11 12 131415-17 18 Экзоны
1 1 1 1
1
-1400 п.н.
III ■
■ Кодирующая область □ Нетранслируемая область
1-й
CpG-островок
2-й
CpG-островок
Рис. 1. Структурная организация гена БЕМАЗБ. Показаны экзоны и два СрО-островка: 1-й СрО-островок - в промо-торной области гена и 2-й СрО-островок - в интроне 1 (по базе КСЫ версия 36). 1-й СрО-островок содержит 22 СрО-динуклеотида на участке 832 п. н., а 2-й СрО-островок - восемь СрО на участке 400 п.н.
Образец ДНК Бисульфитное секвенирование МСП
4 3 4 |5ТбТ7Т8| 9 10 11 12|13Т14И5Т16И7] 3,4,9-12
КН 39
и и А49
н и Caki 1
л е Caki 2
3 н TK 164
F о TK 10
т е HN 51
л Кл ACHN
KRC/Y
348
367
397
ь л 333
о X 503
£ 377
О 802
528
555
348
367
397
а м 333
р о 503
Н 377
802
528
555
Рис. 2. а - Примеры анализа метилирования промоторного СрО-островка гена SEMA3B с помощью бисульфитного секве-нирования и МСП в ДНК 9 клеточных линий RCC и в 9 парных образцах первичного RCC. Всего двумя методами изучено 16 парных (опухоль/норма) образцов первичного RCC; данные для семи случаев RCC (< 500, 501, 502, 340, 863, 692, 354), в которых метилирование гена не выявлено ни в ДНК "условной нормы", ни в ДНК опухоли, не приведены. Сверху указаны номера изученных CpG-динуклеотидов. Методом бисульфитного секвенирования проанализированы 16 CpG (< 2-17). Шесть CpG (< 3, 4, 9, 10, 11, 12) проанализированы двумя методами. Метилированные CpG выделены серым, неметилиро-ванные - белые; номера шести CpG, проверенных двумя методами, отмечены серым. б - Сопоставление результатов определения метилирования двух CpG-островков гена SEMA3B методом МСП и полученных ранее [6] данных по изменению уровн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.