ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 2, с. 262-268
УДК 581.143:575.143:575.15:575.17
ДВА ГОМОЛОГА ГЕНА FLOWERING LOCUS C ИЗ РАСТЕНИЙ САРЕПТСКОЙ ГОРЧИЦЫ (Brassica juncea Thell.)
© 2004 г. В. В. Мартынов, Э. Е. Хавкин
Институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук, Москва
Поступила в редакцию 30.05.2003 г.
Методом прямой амплификации геномной ДНК, выделенной из двух сортов сарептской горчицы (Brassica juncea), получены два гомолога MADS-box гена FLOWERING LOCUS C, который контролирует продолжительность периода до цветения у растений арабидопсиса. Нуклеотидные и производные аминокислотные последовательности двух клонированных фрагментов FLC (со 2 по 7 экзон) сопоставлены с ранее охарактеризованными генами FLC у арабидопсиса и его гомологами у других видов Brassicaceae. Гомолог AY266265 является ортологом гена FLC3 Brassica rapa (95% гомологии), а функциональная принадлежность гомолога AY268931 окончательно не установлена. На примере гена FLC и его гомологов оценена сравнительная изменчивость первичного строения экзонов и ин-тронов.
Arabidopsis - Brassica - MADS-box гены - скорость развития - цветение - полиморфизм экзонов и интронов
В последние годы удалось охарактеризовать многие гены, контролирующие морфогенез и скорость развития растений арабидопсиса, риса, кукурузы, томатов и т.п. Однако у большинства экономически важных видов растений до сих пор неизвестны гены, стоящие за такими признаками, как строение побега, соцветия и цветков, структура фотосинтетического полога, скорость развития и структура урожая. Процесс идентификации агрономически важных генов-кандидатов можно ускорить, если обратиться к структурным гомологам уже охарактеризованных генов, выполняющих сходные физиологические функции у систематически близких видов растений [1-4]. Благодаря успешным исследованиям арабидопсиса, семейство Brassicaceae открывает наибольшие возможности для такого рода исследований [2-10].
Род Brassica включает много важных пищевых и кормовых растений, которые различаются по конституции генома и жизненным формам. Многие из генов, которые определяют продолжительность вегетативного развития (число дней до цветения) у различных форм Brassica и их переход к цветению, описаны и картированы только по их фенотипическому проявлению; лишь в некоторых случаях эти гены клонированы и оха-
Сокращения: FLC- FLOWERING LOCUS C. Адрес для корреспонденции: Хавкин Эмиль Ефимович. 127550 Москва, Тимирязевская ул., 42. Институт сельскохозяйственной биотехнологии. Факс 07 (095) 977-09-47; электронная почта: emil@iab.ac.ru
рактеризованы [5-10]. Среди известных генов, контролирующих переход к цветению, особое место принадлежит гену FLOWERING LOCUS C (FLC) [9, 11-18]. Предполагают, что FLC является ключевым звеном при переходе растений к цветению после холодовой индукции (яровизации): доза гена FLC определяет весь спектр жизненных форм Brassicaceae, от яровых до двулетних растений [16]. Кроме того, у растений рода Brassica часть локусов FLC косегрегирует с признаком числа дней до зацветания [9, 17].
К настоящему времени полноразмерный ген FLC охарактеризован только у арабидопсиса [11-13], а из растений B. napus, B. rapa, B. oleracea и Raphanus sativus выделена полноразмерная кДНК, соответствующая FLC ([18]; Park и др., 2003, неопубл.). Кроме того, гомологи FLC, включающие экзоны 2-7 и находящиеся между ними интроны, клонированы из растений B. rapa и B. oleracea [17]. В нашем сообщении описаны гомологичные фрагменты генов FLC из растений сарептской горчицы (B. juncea).
МЕТОДИКА
Материалом для исследований служили двухнедельные проростки сарептской горчицы (Brassica juncea Thell., позднеспелый сорт Snerry fond № 557588 по каталогу ВИР и среднеспелая форма № 4594 по каталогу ВИР), которые выращивали при непрерывном освещении и температуре 22-24°С. Геномную ДНК выделяли модифицированным методом Sagai Maroof и др., как описано ра-
нее [19]. Для амплификации фрагмента генома, соответствующего участку 3658-5589 гена FLC арабидопсиса (Genbank accession no. AF116528), использовали праймеры GATCCTTGATCGATATGG-GAAA и GCTAATTAAGTAGTGGGAGAGTCAC [17]. Олигонуклеотиды синтезировали в фирме "Синтол" (Россия). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в термоциклере Терцик ("ДНК-технологии", Россия). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 50 нг геномной ДНК, 1 единицу Tag-полимеразы ("Fermentas", Литва), 2.5 мМ MgCl2, по 0.25 мМ каждого из четырех де-зоксирибонуклеозидтрифосфатов и по 10 пкмоль каждого из двух олигонуклеотидов. Протокол амплификации включал предварительную денатурацию ДНК при 94°С в течение 1 мин, 35 циклов, включающих 30 сек денатурации при 92°С, 30 сек при 58°С для отжига праймеров с матрицей и 1 мин 30 сек при 72°С для синтеза, и завершающий синтез при 72°С в течение 3 мин.
Для разделения продуктов амплификации использовали электрофорез в 1% агарозном геле ("Chemapol", Чехия) в присутствии бромистого этидия. Визуализацию продуктов амплификации осуществляли при помощи трансиллюминатора УВТ1, оборудованного видеосистемой для регистрации гелей "гель-1-биоком" (ООО "Компания Биоком", Россия). Длину амплифицированных фрагментов ДНК определяли с помощью маркера Gene Ruler 1kb DNA Ladder ("Fermentas"). Специфические продукты амплификации, соответствующие по размеру целевому фрагменту FLC арабидопсиса, очищали от посторонних ПЦР-фрагментов методом препаративного электрофореза в агарозном геле и элюировали из агароз-ного геля согласно протоколу DIAtom™ DNA Prep 100 ("Компания Биоком").
ПЦР-фрагменты геномной ДНК B. juncea ли-гировали в вектор pGEM-T в соответствии с инструкцией фирмы производителя ("Promega", США), полученные рекомбинантные плазмиды клонировали в клетках E. coli штамма DH5a. Для отбора клонов, содержащих рекомбинантные плазмиды, использовали бело-голубую селекцию по протоколу фирмы производителя ("Promega"). Плазмидную ДНК из отобранных колоний выделяли методом щелочного лизиса. Для идентификации встроенного фрагмента гена проводили амплификацию плазмидной ДНК с указанными выше праймерами к гену FLC.
Нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК, клонированных в составе pGEM-T, определяли дидезокси методом на автоматическом анализаторе ABI 310 Prism ("PE Biosystems", США) с прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров ("Синтол"), подобранных к фланкирующим вставку участкам плазмиды pGEM-T (AAT-TGGGCCCGACGTC и CATATGGTCGACCTG-
CAGG). Производные аминокислотные последовательности были получены с помощью программы GENEPRO 4.20 ("Riverside Scientific", США). Для кластерного анализа использовали программу MEGALIGN ("DNASTAR", США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Используя праймеры, распознающие высококонсервативные последовательности во 2 и 7 эк-зонах гена FLC арабидопсиса, мы получили два фрагмента генома растений B. juncea длиной 1588 и 1688 п.н. Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов были сопоставлены с геном-прототипом. Границы между экзонами и интронами были определены путем сравнения эк-зонных последовательностей гена FLC арабидопсиса с полученными нами последовательностями, а также путем проверки наличия консервативных сайтов сплайсинга на 5'- и 3'-концах интронов. В результате было установлено, что по своей эк-зонно-интронной структуре полученные фрагменты в целом соответствуют гену-прототипу FLC арабидопсиса; сходство кодирующих последовательностей между геном FLC и полученными нами фрагментами составляет 84%. На этом основании мы идентифицировали полученные фрагменты генома B. juncea как гомологи гена FLC и зарегистрировали их в Генбанке как accession nos. AY266265 и AY268931. Отличия гомологов из B. juncea от гена-прототипа связаны с длиной интронов (таблица) и заменами во всех шести экзонах: 54 замены в гомологе AY266265 и 49 замен в гомологе AY268931, в обоих случаях 16 замен были синонимическими. Между собой два гомолога из B. juncea различаются по общей длине, главным образом, за счет интронов 2 и 6; в кодирующей части два гомолога различаются на 24 нуклеотида, причем шесть замен являются синонимическими.
Использование фрагментов FLC в качестве зондов при генетическом картировании позволяет сопоставить ген FLC с локусами, картированными ранее по фенотипу [6-9, 17]. Как показали Schranz и др. [17], у B. rapa из пяти форм FLC только три, BrFLCl, BrFLC2, и BrFLC5, косегрегиру-ют с локусами, определяющими число дней до цветения (соответственно, VFR2, FR1 и FR2).
Чтобы определить, к какой форме FLC принадлежат гомологи, выделенные нами из B. juncea, и таким образом идентифицировать их физиологическую функцию, мы провели выравнивание производных аминокислотных последовательностей гена FLC арабидопсиса и его гомологов. Для этого мы сравнили полученные нами фрагменты с геном-прототипом и структурными гомологами FLC у арабидопсиса, а также со всеми известными к настоящему времени ортологами и гомологами FLC у других растений семейства Brassicaceae, ис-
215.6
г BrFlCh3
"L BrFlCh4
— BjFlC3 BrFlCh1
— BrFlC3 BrFlCh2
— BnFlC3 BoFlCh1 BoFlC3 BrFlC5
_L BnFlC5 BoFlC5 BnFlC4 BnFlC2
- RsFlChl
BjFlCx
_I BrFlCl
fL BnFlCl 1— BoFlCl
-AtFlC
-AtMAF5ll
AtMAF5l
-AtFCL2
-AtFCLl
AtMAF4 AtMAF3ll AtMAF3l AtMAF2 -AtMAFl
200
l50
l00
50
0
Рис. 1. Сравнение производных аминокислотных последовательностей гена FLOWERING LOCUS C (FLC) арабидопси-са (2-7 экзон) и его гомологов у арабидопсиса и других растений семейства Brassicaceae. По оси абсцисс - генетические расстояния Нея.
AtFLC - белок FLC арабидопсиса (GenBank accession no. AAD2l249); AtMAFl, AtMAF2, AtMAF3I, AtMAF3II, AtMAF4, AtMAF5I и AtMAF5II - MAF белки арабидопсиса (соответственно, AAK37527, AA065307, AA0653l0, AAO653ll, AA0653l5, AA065320 и AA06532l); AtFCLl и AtFCL2 - гомологи FLC из арабидопсиса (AAG43854 и AAG43855); Bn-FLC-BnFLC5 - гомологи FLC из Brassica napus (соответственно, AAK702l5-AAK702l9); BrFLChl-BrFLCh4 и BrFLCl, BrFLC3 и BrFLC5 - гомологи FLC из B. rapa (AAP3l678-AAP3l68l, AA0l3l59-AA0l3l57); BoFLChl, BoFLCl, BoFLC3, BoFLC5 - гомологи FLC из B. oleracea (AAP3l677, AAN87902, A
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.