ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 47, № 1, с. 95-101
УДК 575.631
ДЫХАТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК Polyscias filicifoia Bailey, Stephania glabra (Roxb.) Miers И Dioscorea deltoidea Wall
© 2011 г. М. В. Титова**, Е. А. Беркович**, О. В. Решетняк*, И. Е. Куличенко*,
А. В. Орешников*, А. М. Носов**
*Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва, 127276 **Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992
e-mail: titomirez@newmail.ru Поступила в редакцию 06.11.2009 г.
Охарактеризованы особенности дыхания культур клеток—продуцентов биологически активных соединений (изопреноиды и алкалоиды) с целью оптимизации продуктивности культур по росту и биосинтезу. Установлено, что исследуемые культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall (продуцент фуростаноловых гликозидов), Stephania glabra (Roxb.) Miers (продуцент алкалоида стефарина) и Polyscias filicifolia Bailey (комплекс биологически активных веществ) отличались как по общей интенсивности дыхания, так и по соотношению цитохромного и цианидрезистенстного дыхания, причем изменения скорости общего поглощения кислорода и активности альтернативной оксидазы в процессе роста индивидуальны для каждой из исследуемых культур. Максимальная скорость поглощения кислорода для культур клеток D. deltoidea и S. glabra отмечена в период, предшествующий активному синтезу вторичных метаболитов (лаг-фаза для D. deltoidea и экспоненциальная фаза для S. glabra). Полученные закономерности могут быть использованы для дальнейшего мониторинга и регуляции роста и биосинтеза вторичных соединений в культурах клеток—продуцентов при глубинном культивировании.
Культуры клеток высших растений являются альтернативным способом получения растительного сырья для медицины, ветеринарии, парфюмерии и пищевой промышленности [1]. При создании эффективной технологии для реализации поставленных задач (синтез вторичных метаболитов, накопление биомассы, т.д.) необходимо учитывать особенности состояния клеток при выращивании in vitro [2, 3]. В частности, важную информацию об изменении физиологического состояния клеток в ходе ростового цикла можно получить при анализе дыхательной активности культур.
Дыхание растительных клеток — сложный регулируемый процесс, представляющий собой совокупность окислительно-восстановительных реакций, которые служат источником конвертируемых форм клеточной энергии в виде Л^н+ и АТФ и промежуточных
метаболитов, вовлекаемых в общий клеточный обмен и использующихся в различных биосинтезах [4]. Характерной особенностью электрон-транспортной дыхательной цепи (ЭТЦ) клеток растений является наличие двух возможных путей переноса электронов — основного цитохромного (через ингибируе-мую цианидом цитохромоксидазу) и цианидрези-стентного альтернативного пути (АП). Их вклад в общее поглощение кислорода варьирует в достаточно широких пределах и зависит от многих факторов, в частности от содержания и активности соответствующих ферментов, от степени восстановленности ЭТЦ, доступности дыхательных субстратов и др. [5].
При АП обеспечивается передача электронов от убихинона на кислород в обход двух участков ЭТЦ (комплексы III и IV), что является энергетически менее эффективным, чем использование цитохромного пути. Однако проведенные многочисленные исследования подтверждают важную роль АП в поддержании метаболизма растительной клетки. [6—10] Показано, что работа альтернативной окида-зы (АО) позволяет поддерживать функционирование цикла Кребса и осуществлять транспорт электронов в условиях ингибирования цитохромного пути [10]. Кроме того, АП регулирует баланс восстановленных переносчиков электронов, снижая возможность образования активных форм кислорода, а также может способствовать активному росту растительных клеток [6, 7]. Активация АП в ответ на неблагоприятные внешние воздействия (низкие температуры [11], условия окислительного стресса [6, 7], дефицит питательных компонентов [12]) говорит об участии АО в системе сигнальных механизмов защиты растительных клеток от стрессов различного типа [13, 14].
Суспензионные культуры клеток высших растений представляют собой популяцию соматических клеток, находящихся в относительно равных условиях, что позволяет использовать клетки in vitro в качестве экспериментальных модельных систем при изучении фундаментальных вопросов биологии клетки, в частности для исследования дыхательного метаболизма [13, 15, 16]. В этом аспекте большой интерес представляют трансгенные куль-
туры клеток с различной активностью АО [9, 17]. Измерение общей скорости поглощения кислорода является распространенным методом контроля метаболической активности растительных клеток in vitro при выращивании в колбах или аппаратном культивировании и может адекватно отражать реакцию культур клеток на изменение условий выращивания (изменение температуры, рН, осмотический стресс, ингибирование, дефицит питания) [13, 18]. Однако при глубинном культивировании растительных клеток до настоящего времени мало внимания уделялось исследованиям взаимосвязи различных путей дыхательного обмена с процессами роста клеток и синтезом вторичных метаболитов. Практический интерес также представляет сравнение вкладов цитохромного и цианидрезистентного дыхания для штаммов культур клеток высших растений, принадлежащих к разным видам, отличающихся механизмами адаптации к стрессовым условиям и по классам синтезируемых вторичных метаболитов.
Цель работы — исследование общей интенсивности дыхания и вклада различных путей дыхательного обмена в суммарное поглощение кислорода культурами — продуцентами вторичных метаболитов в связи с процессами роста и биосинтеза соответствующих соединений, а также оценка адекватности использования предложенной методики для экспресс-анализа изменений физиологического состояния популяции клеток in vitro в ходе глубинного культивирования в биореакторах.
МЕТОДИКА
Объекты исследования. Использовали следующие суспензионные культуры клеток, депонированные в ВККК ВР ИФР РАН под соответствующими номерами:
1. Dioscorea deltoidea Wall, мутантный штамм— сверхпродуцент фуростаноловых гликозидов ИФР ДМ-0.5 (коллекционный № 6).
2. Polyscias filicifolia Bailey, коллекционный штамм BFT-001-95 (№ 58).
3. Stephania glabra (Roxb.) Miers, коллекционный штамм 113, продуцент алкалоида стефарина (№ 67).
Культуры выращивали в колбах объемом 2 л на модифицированных средах Мурасиге—Скуга. Для всех штаммов величина инокулюма находилась в пределах 2.4—2.8 г сухого материала/л среды при жизнеспособности культур 87—93%. Цикл субкультивирования составлял 2 нед. Культуры выращивали в темноте на качалке (80—100 об/мин) при 26— 27°С и влажности 70-75%.
Для характеристики роста и физиологического состояния культур использовали массы сухих и сырых клеток, а также жизнеспособность и концентрацию клеток.
Жизнеспособность определяли под микроскопом, как процент не окрашиваемых 0.025%-ной
синькой Эванса клеточных агрегатов. Просчитывали не менее 250 агрегатов в трех повторностях.
Для подсчета числа клеток 0.5 мл суспензии инкубировали с 2.0—2.5 мл 20%-ного раствора хромовой кислоты при 60°С в течении 15—20 мин, в зависимости от возраста и типа суспензии. Число клеток просчитывали в камере Фукса—Розенталя.
Полярографический метод. Определение вкладов различных путей дыхания в общее поглощение кислорода производили при помощи полярографической установки с ячейкой открытого типа и электродом Кларка при 27°С. Для измерений использовали суспензию клеток (из расчета 10 и 40 г сырой биомассы клеток/л среды). Для определения вклада различных путей дыхания использовали ингибиторы: 5 мМ азид натрия, подавляющий цитохромок-сидазный комплекс, и 10 мМ салицилгидроксамо-вую кислоту, блокирующую АП. Уровень альтернативного дыхания определяли по разнице в скорости поглощения кислорода под воздействием соответствующих ингибиторов. Остаточное дыхание, связанное с функциями цитоплазматических оксидаз, определяли как уровень поглощения кислорода (в %), который оставался после внесения обоих ингибиторов.
Cпектрофотометрический метод определения фуро-станоловых гликозидов (олигофуросганозиды). Навески биомассы (50—200 мг) экстрагировали 70%-ным водными метанолом (концентрация олигофуростано-зидов в экстракте в пределах 0.01—0.20 мг/мл). После осаждения клеточной биомассы в отдельные пробирки отбирали 0.20 мл супернатанта, добавляли 0.50 мл реактива Эрлиха (1%-ный раствор n-диметламино-бензальдегида в смеси соляная кислота—метанол, 34 : 66 v/v), выдерживали при 50 ± 1°С в течение 2 ч. После охлаждения доводили объем до 2.2 мл и измеряли поглощение при 520 нм. Концентрацию оли-гофуростанозидов вычисляли по калибровочному графику, построенному по чистому препарату дельто-зида [19].
Анализ алкалоида сгефаглабрина сульфата. 60 мг
высушенной биомассы культуры клеток S. glabra заливали 1 мл водного раствора 0.1%-ной серной кислоты, перемешивали и оставляли на 18—20 ч. 6 мкл надосадочной жидкости наносили микрошприцом на ТСХ-пластины с сорбентом Kieselgel 60 F254 ("Merck", Германия). Пластины хроматографировали в системе растворителей хлороформ—бензол—эта-нол-25%-ный раствор аммиака (50 : 80 : 100 : 0.02). Rf стефарина около 0.25 [20]. Количественную оценку содержания алкалоида проводили путем денсито-метрирования пятна стефаглабрина на пластинке при 254 нм (денситометр ЗАО "Сорбполимер", Россия). Для расчета использовали метод абсолютной калибровки с учетом влажности исследуемой биомассы. В качестве стандарта и для построения калибровочной кривой использовали спиртовые растворы стефаглабрина сульфата (ВИЛР, Россия).
сут сут
сут
Рис. 1. Динамика роста и физиологические характеристики суспензионных культур клеток D. deltoidea (а), P. filicifolia (б) и S. glabra (в) в полулогарифмической системе координат: 1 - масса сырых клеток, lnX/Xq, 2 - масса сухих клеток, lnX/Xq, 3 - концентрация клеток, ln X/Xq.
Предел детектирования для стефаглабрина сульфата — 0.1 мкг в пятне.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Динамика роста и биосинтеза. Для всех штаммов иссле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.