БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.5, c.901-907
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 577.3; 535.37
ЭФФЕКТ ИШЕМИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ ПРИ ИШЕМИЧЕСКОМ ИНСУЛЬТЕ ПО ОЦЕНКЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ЛИПОПР ОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ ПЛАЗМЫ КР ОВИ КРЫС СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
© 2009 г. И.М. Власова, Е.В. Долматова*, В.Б. Кошелев*, А.М. Салецкий
Физический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119992, Москва, Воробьевы Горы;
E-mail: vlasovairina1979@mail.ru *Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119992, Москва, Воробьевы Горы Поступила в p едакцию 15.08.07 г. После доработки 31.01.08 г.
C помощью оптико-спектральных методов показано, что ишемическое пр екондиционир ование, выполненное пер ед ишемическим инсультом, оказывает защитное действие на ткани головного мозга, регистр ируемое по уменьшению повреждения липопротеинов низкой плотности крови после ишемического инсульта.
Ключевые слова: ишемический инсульт, прекондиционирование, липопротеины низкой плотности, спектроскопия комбинационного рассеяния света, флуоресцентный анализ.
Ишемический инсульт представляет собой острое нарушение мозгового кровоснабжения, возникающее при критическом снижении мозгового кровотока вследствие р асстройства общей гемодинамики или пр и окклюзии сосудов, снабжающих кровью мозг. Патогенез ишеми-ческого инсульта многообразен, но основную роль играют гипоксия и ишемия головного мозга (церебр альная ишемия). В данной работе ишемический инсульт у крыс вызывали проведением процедур ы глобальной (1,5-часовой) ишемии головного мозга. Как известно, головной мозг снабжается кровью одновременно четырьмя магистральными ар тер иями - парными внутренними сонными (arteria сагоЙ8 interna) и парными позвоночными (arteria vertebralis). В данной работе модельная глобальная ишемия головного мозга вызывалась путем пережатия у животных обеих внутренних сонных артерий, оставшееся кровоснабжение через позвоночные ар тер ии не обеспечивало адекватное кровоснабжение головного мозга.
В последние годы в медицинских аналитических исследованиях растет интерес к процедуре ишемического прекондиционирования [1-
Сокращения: ЛПНП - липопротеины низкой плотности, КР - комбинационное рассеяние, АФК - активные формы кислорода.
3]. Ишемическое прекондиционирование представляет собой серию непродолжительных циклов «короткой ишемии - реперфузии», предшествующих длительной глобальной ишемии данного органа. Прекондиционирование является тренировкой органа перед длительной ишемией короткими периодами ишемии.
Ранее нами были зарегистрированы изменения (увеличение размеров и уменьшение плотности) липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) крови животных после ишемического инсульта [4]. Методом комбинационного рассеяния света и методом спектрально-люминесцентного анализа показано, что эти изменения ЛПНП объясняются разрыхлением фосфоли-пидного слоя ЛПНП под действием свободно-радикальных продуктов, появляющихся вследствие ишемии в клетках тканей головного мозга, а затем попадающих в кровоток [5,6].
Представляет интерес изучение защитного эффекта ишемического прекондиционирования, пр оведенного пер ед глобальной ишемией головного мозга, вызывающей ишемический инсульт, по оценке свободнорадикальных липо-пер екисных повреждений ЛПНП сыворотки крови после ишемического инсульта спектроскопическими методами.
0.75г
0-70
К ffl
0.60
0.55^_,_,
1835 1830 1825
Рамановское смещение, см-1
Рис. 1. КР-спектры контрольной сыворотки крови здоровых интактных крыс (7), сыворотки крови кр ы с после ишемического инсульта с пр екондицио -нир ованием (2) и сыворотки кр ови кр ыс после ишемического инсульта без пр екондиционир ования (5) в диапазоне 1825-1835 см-1. Число к р ыс в каждой группе п = 10.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Р аботу пр оводили на сывор отке кр ови кр ы с популяции Вистар (молодые самки массой 200 ± 30 г). Первая, контрольная группа крыс не подвер галась никаким воздействиям. Животные второй и третьей групп предварительно наркотизировались внутрибрюшинной инъекцией хлор алгидр ата (350 мг/кг). У втор ой группы животных (без проведения ишемического пре-кондиционирования) полная глобальная ишемия головного мозга достигалась путем пре-кр ащения тока кр ови чер ез обе внутр енние сонные артерии на 1,5 часа. У третьей группы животных ишемическое пр екондиционир ование достигалось путем попеременного пережатия каждой из двух внутренних сонных артерий по 5 минут (для каждой сонной артерии было проведено последовательное чередование двух коротких периодов ишемии по 5 минут и репер фузии), далее следовал пер иод глобальной длительной ишемии головного мозга (обе артер ии единовр еменно пер ежимали сь на 1,5 часа). Каждая группа кры с со стояла из 10 животных. Забор кр ови у животных пр оводили из яр емной вены. С тандартно полученную сы -во р отку кр ови [4] использовали в дальнейших исследованиях.
Были получены обр азцы сывор отки кр ови тр ех типов: 1 - контр ольные обр азцы сывор от-ки крови здоровых интактных животных без пр оведения каких-либо пр оцедур; 2 - обр азцы
сывор отки кр ови животных по еле ишемического инсульта без пр едвар ительного ишемического пр екондиционир ования; 3 - обр азцы сыворотки кр ови животных по сле ишемического инсульта с пр едвар ительно пр оведенным ишеми-ческим прекондиционированием. Данные три типа обр азцов сывор отки кр ови исследовали двумя различными спектр о скопическими методами.
Методом спектр о скопии комбинационного рассеяния (КP) света детектировались изменения химического стр оения ЛПНП сывор отки кр ови, вызванные окислительным стр ессом вследствие появления свободнор адикальных со -единений по сле ишемического инсульта. И ссле-дования пр оводили с помощью К P-установки EQUINOX 55 с приставкой FRA-106 (Bruker), длина волны возбуждающего света 1064 нм (Nd-YAG лазер). Мощность возбуждающего лазер а составляла 230 мВт, измерения одного обр азца сывор отки пр одолжались порядка 300 сканов (15 мин). Разрешение КР-спектра со -ставляло 0,2 см-1. Полученные спектры обрабатывали с помощью программы OPUS 4.2 (Bruker).
Второй метод, используемый для исследования повреждения ЛПНП сыворотки крови по сле ишемического инсульта, - метод флуо -р есцентного анализа. C пектр ально-флуо р ес-центные характеристики сывор отки кр ови и добавленного в нее молекуляр ного зонда (р о -дамина 6Ж) исследовали на спектр офлуор имет-р е LS 55 (Perkin Elmer). Спектр ы флуо р есценции обр абатывали с помощью пр огр аммы FL Win-lab (Perkin Elmer).
P ЕЗУЛЬТАТЫ
КР-спект ры исследуемых систем. Изменения ЛПНП вследствие ишемии головного мозга объясняются в рамках свободнорадикальной теории окислительного стресса [5,6]. В процесс окисления ЛПНП вовлекаются пр еимуществен-но ненасыщенные жирные кислоты из наружного амфипатического фо сфолипидного монослоя ЛПНП, в р езультате обр азуются липопе-р екисные пр одукты.
Исследовали рамановские пики, отвечающие за химические связи в углеводородных цепях ненасыщенных жирных кислот фосфоли-пидного амфипатического слоя ЛПНП. КP-спектры исследуемых систем, представленные на р ис. 1-2, нор мир ованы на величину максимальной интенсивности К P-сигнала в рассматриваемых диапазонах - на величину интенсивно сти ^-пика пр и 1024 см-1 (р ис. 2а).
Р ис. 2. К Р-спектр ы контр ольной сывор отки кр ови здо р овых интактных кр ыс (7), сывор отки кр ови кр ыс после ишемического инсульта с пр екондиционир ованием (2) и сывор отки кр ови кр ыс после ишемического инсульта без пр екондиционир ования (3) в диапазоне 1015-1030 см-1 (а) и в диапазоне 1750-1760 см-1 (б). Число кр ыс в каждой гр уппе п = 10.
Как показали наши исследования, после ишемического инсульта в КР-спектрах сыво-р отки кр ови появляется пик пр и 1830 см-1 (р ис. 1), соответствующий обр азованию липопер еки с-ных продуктов вследствие окисления жирных кислот в фосфолипидах амфипатического слоя ЛПНП. Площадь К Р-пика на частоте 1830 см-1 пр и пр едвар ительном пр оведении пр екондицио -нирования уменьшается примерно в 1,5 раза (табл. 1), что указывает на уменьшение образования липопер екисных пр одуктов в фо сфо -липидах амфипатического слоя ЛПНП.
На рис. 2 пр едставлены К Р-спектр ы исследованных си стем в интер валах ча стот 1015-1030 см-1 (а) и 1750-1760 см-1 (б). Видно, что после ишемического инсульта происходит уменьшение интенсивно стей пика пр и 1024 см-1, отвечающего за двойные связи (С=С) в нена сыщен-ных жир ных кислота х, входящих в со став фо с-фолипидов ЛПНП, и пика пр и 1755 см-1, ха -р актер изующего сопряженные двойные связи в нена сыщенных жир ных кислотах фо сфолипидов амфипатического монослоя ЛПНП. При этом
Таблица 1. Площади К Р-пиков, ответственных за изменяющиеся пр и ишемическом инсульте химические связи в ненасыщенных жир ных кислота х фосфолипидного слоя ЛПНП
Положение максимума пика, см-1 Тип пика (уменьшившийся / появившийся после ишемического инсульта) Площадь, отн.ед .2
Данные для сывор отки кр ови здор овых интактных животных (п = 10)
1024 1755 1830 Был у здо р овых интактных кр ы с Был у здо р овых интактных кр ы с Отсутствует у здор овых интактных крыс 9,7 ± 0,3 11,0 ± 0,5
Данные для сывор отки кр ови животны х, пер енесших ишемический инсульт без пр оцедур ы пр екондиционир ования (п = 10)
1024 1755 1830 Уменьшается после инсульта Уменьшается после инсульта Появляется после инсульта 2.7 ± 0,2 3,5 ± 0,2 7.8 ± 0,3
Данные для сывор отки кр ови животных, пер енесших ишемический инсульт с пр едвар ительной п р оцедур ой пр екондиционир ования (п = 10)
1024 1755 1830 Уменьшается после инсульта Уменьшается после инсульта Появляется после инсульта 6,0 ± 0,2 6,3 ± 0,3 5,3 ± 0,2
Рис. 3. Спектры флуоpеcценции (Авозб = 350 нм) сывор отки кр ови: 1 - контр ольные обр азцы сыво-р отки кр ови здор овых интактных кр ы с, 2 - обр азцы сывор отки кр ови кр ы с после ишемического инсульта с пр екондиционир ованием, 3 - обр азцы сыворотки крови крыс после ишемического инсульта без пр екондиционир ования. Число кр ыс в каждой гр уппе п = 10.
их площади также уменьшаются: д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.