ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 4, с. 254-261
МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
УДК 591
ЭФФЕКТ ЛОКАЛЬНОЙ МИКРОАППЛИКАЦИИ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА МЕМБРАННЫЕ ТОКИ РАННИХ ЗАРОДЫШЕЙ Paracentrotus lividus1
© 2007 г. Ю. Б. Шмуклер, Э. Тости*, Ф. Силвестре*
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 *Stazione Zoologica "Anton Dohrn" 80121 Villa Comunale, Napoli, Italia E-mail: ybs@hotbox.ru Поступила в редакцию 28.11.06 г.
На зародышах морского ежа Paracentrotus lividus в период 1-го деления дробления показано, что локальная аппликация агонистов серотониновых рецепторов 3-го типа 5-HTQ и квипазина в межбла-стомерную щель вызывает специфические мембранные токи. Одновременно лиганды 5-НТ3-рецеп-торов специфически влияют на тип дробления половинных зародышей, имитируя или устраняя межбластомерный сигнал. В свете полученных данных обсуждается уточненная концепция прото-синапса, в которой распространение мембранных серотониновых рецепторов ограничено периодом формирования бластомеров в ходе деления дробления и локализовано в области межбластомерного контакта.
Ключевые слова: серотонин, рецепторы, межклеточные взаимодействия, деления дробления, морские ежи.
Медиаторы нервной системы, такие как серотонин, катехоламины и ацетилхолин, в период раннего (донервного) эмбриогенеза участвуют в нескольких ключевых процессах. В случае морских ежей - это, в первую очередь, запуск клеточного цикла, контроль состояния цитокортекса (Бузников, 1987), завершение формирования борозды дробления (Shmukler et а1., 1999), адгезии бластомеров после деления (Бузников, Шмуклер, 1978) и, наконец, прямые межбластомерные взаимодействия (Шмуклер, 1981, 1992). Участие этих веществ в раннем эмбриогенезе характеризуется как химической специфичностью, так и различной локализацией соответствующих рецептивных структур (далее - рецепторов): если процессы запуска делений дробления и адгезии бластомеров опосредованы внутриклеточными рецепторами (Бузников, Шмуклер, 1978; Shmuk1er et а1., 1986; Бузников, 1987), то в процессах межбластомер-ной сигнализации, по-видимому, участвуют рецепторы поверхностной мембраны (Шмуклер, 1992; Shmuk1er, 1993; Shmuk1er, ^и, 2002).
Участие медиаторов в межбластомерных взаимодействиях обосновывается способностью антагонистов серотонина вызывать функциональную
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 05-04-48293).
изоляцию бластомеров (Бузников, Шмуклер, 1978), а также специфическими эффектами серо-тонинергических веществ на так называемой "микромерной модели", т.е. их способностью влиять на паттерн дробления зародышей морских ежей, развивающихся из бластомеров, изолированных в ходе 1-го деления дробления (Шмуклер, 1981). И на зародышах плоского морского ежа Scaphechinus mirabilis, и на зародышах Paracentrotus lividus серотонинергические препараты, плохо проникающие в клетку, эффективно влияли на паттерн дробления, наиболее вероятно, через рецепторы поверхностной мембраны (Шмуклер, 1992). Кроме того, было продемонстрировано специфическое связывание меченого лиганда серотониновых рецепторов в условиях, когда его проникновение в клетку было максимально ограничено (Шмуклер, 1992).
На первом этапе этих исследований еще не существовало развитой фармакологии серотониновых рецепторов и не представлялось возможным определить их типы. Однако уже в опытах по изучению влияния серотонинергических препаратов на уровень внутриклеточных ионов кальция выявилась эффективность лигандов серотониновых рецепторов 3-го типа (Shmukler et al., 1999). Далее, плохо проникающий в клетку агонист серотониновых рецепторов 3-го типа (5-НТ3) 5-HTQ
при фиксации потенциала в конфигурации whole-cell избирательно вызывает специфические входящие токи в бластомерах Paracentrotus lividus, приуроченные к периоду формирования борозд 1-го и 2-го делений дробления. В отличие от него агонист 5-НТ1-рецепторов токов не вызывал, а агонист 5-НТ2-рецепторов вызывал их в течение всего клеточного цикла (Shmukler, Tosti, 2002). Это, с одной стороны, также свидетельствует о наличии в поверхностной мембране указанных серотонинрецептивных структур, а с другой - о наличии у них некоторой фармакологической специфичности.
В нашей работе продолжено изучение фармакологической чувствительности ранних зародышей, в частности специфичности их серотонино-вых рецептивных структур, участвующих в меж-бластомерных взаимодействиях, и предпринята попытка исследовать распределение этих структур по поверхности бластомеров.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Гаметы. Женские гаметы морского ежа P. lividus (Неаполитанский залив Средиземного моря, Италия) получали, инъецируя самкам 0.05 мл раствора KCl в концентрации 0.5 M. Мужские гонады собирали целиком и разбавляли "сухую сперму" морской водой непосредственно перед искусственным оплодотворением, которое, так же как и удаление оболочки оплодотворения и гиалинового слоя, проводили, как это описано ранее (Yazaki et al., 1995). Непосредственно перед началом фиксации потенциала и измерения токов зародыши переносили в нормальную морскую воду, измерения начинали с момента закладки борозды 1-го деления дробления.
Фиксацию потенциала в конфигурации whole-cell проводили, как описано ранее (Yazaki et al., 1995), для чего использовали микропипетку с диаметром кончика около 1 мкм и сопротивлением 5-10 МОм, заполненную раствором, близким по составу к внутриклеточной среде, мМ: 200 KCl, 20 NaCl, 250 сахарозы, 10 ЭГТА, 10 Hepes, pH 7.4. После достижения сопротивления изоляции 40200 МОм мембрану прорывали, наличие отрицательного мембранного потенциала свидетельствовало о контакте микропипетки с цитозолем. Потенциал фиксировали на уровне -40 мВ. В экспериментах использовали только те зародыши, у которых ток фиксации был ниже 200 пА; величины ионных токов, сообщаемые в нашей работе, получены после вычитания тока фиксации. Токи регистрировали с помощью усилителя List EP7 и программного обеспечения Clampfit. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения Axoscope 10.0 и Microsoft Excel, при этом в тех случаях, когда аппликация химических веществ вызывала выходящие токи, их для ужесто-
Рис. 1. Расположение апплицирующих микропипеток: а - в области борозды дробления до адгезии; б -вне контактной области (зародыш прошел адгезию бластомеров после деления). Микропипетка: 1 - ап-плицирующая, 2- измерительная. Масштаб здесь и на рис. 4: 100 мкм.
чения оценки полученных данных усредняли как опыты с нулевым результатом.
Внесение химических веществ в камеру. 2-Ме-тил-серотонин, 5-НТО и никотин (все препараты фирмы "Sigma-RШ", США) с помощью микропипетки вносили до конечной концентрации 100 мкм в наиболее удаленную от пэтчевой пипетки часть экспериментальной камеры объемом 2 мл, чтобы исключить срыв клетки с пипетки, избежать воздействия избыточной концентрации вещества и ограничить механическую помеху при регистрации.
Микроаппликация химических веществ. Ап-плицирующую микропипетку, заполненную раствором химического препарата в концентрации 1 мМ и соединенную с пневматическим микро-инъектором Picospritzer (США), располагали либо на расстоянии 5-10 мкм от борозды 1-го деления дробления, либо на таком же расстоянии от мембраны бластомера вне контактной области (рис. 1). Расположение кончика апплицирующей микропипетки в непосредственной близости от поверхности зародыша определяли по равной резкости ее изображения и изображения микропипетки, фиксирующей потенциал. Аппликацию проводили одиночными импульсами по 10 пл; ис-
Эффекты микроаппликации химических веществ на бластомеры P. lividus
Препарат Место микроаппликации Число опытов (с эффектом : без эффекта) Амплитуда тока, пА Латентный период, с
5-HTQ В область контакта до адгезии 29 (25 : 4) -119.4 ± 18.4 5.1 ± 0.7
Иное, в том числе: 30 (13 : 17) -47.0 ± 14.8 24.4 ± 2.3
- в область контакта после адгезии 11 (5 6) -61.0 ± 31.5 22.0 ± 2.4
- вне области контакта 16 (8 8) -43.4 ± 15.2 25.9 ± 3.7
Квипазин В область контакта до адгезии 12 (8 4) -100.0 ± 42.3 6.1 ± 1.6
Иное, в том числе: 12 (7 5) -73.3 ± 32.6 29.6 ± 4.5
- в область контакта после адгезии 6 (5 : 1) -123.3 ± 58.9 25.3 ± 5.1
- вне области контакта 6 (2 : 4) -23.3 ± 14.8 45.5 ± 4.3
ДМСО В область контакта до адгезии 17 (8 9) -32.2 ± 9.8 30.0 ± 8.0
Иное 6 (2 : 4) -21.2 ± 13.8 45.5 ± 14.5
пользовали агонисты 5-НТ3-рецепторов 5-HTQ (триметилсеротонин йодид) и квипазин (2-(1-пи-перазинил)хинолин малеат) (все препараты фирмы "Sigma", США), а также диметилсульфоксид (ДМСО) в качестве растворителя.
Изоляция бластомеров. Суспензию зародышей, полученных так же, как для опытов по фиксации потенциала, непосредственно перед изоляцией переносили из бескальциевой в нормальную морскую воду. Это особенно существенный момент, поскольку в бескальциевой среде успешная изоляция бластомеров до определенного момента невозможна из-за их разрушения. Изоляцию проводили в период 1-го деления дробления до и после адгезии бластомеров с помощью Г-образной стеклянной иглы с диаметром конечной части около 5 мкм, как это описано ранее (Шмуклер и др., 19816; Shmukler, 1993), в маленьких чашках Петри в присутствии исследуемого химического препарата. Именно замена бескальциевой морской воды на нормальную непосредственно перед началом изоляции позволила предотвратить разрушение бластомеров, изолированных до адгезии. По истечении 10 мин изолированные бластомеры переносили в чашку Петри с нормальной морской водой, затем контролировали момент формирования микромеров у половинных зародышей. Изучали также действие квипазина и антагониста 5-НТ3-рецепторов йодметилата 3-тро-панилиндол-3-карбоксилатана на паттерн дробления половинных зародышей.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Мембранные токи при внесении химических веществ в экспериментальную камеру. Специфичность ранее показанного эффекта лиганда 5НТ3-рецепторов 5-HTQ проверили в опытах с внесением в экспериментальную камеру другого 5НТ3-агониста - 2-метил-серотонина и никотина -
лиганда н-холинорецепторов. 2-Метил-серото-нин (100 мкМ) вызывал входящий ток, сходный с таковым, наблюда
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.