= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 577.218:579.22
ЭФФЕКТ ВВЕДЕНИЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО ГЕНА АЦИЛ-ГОМОСЕРИНЛАКТОНАЗЫ (aiiA) НА СВОЙСТВА ШТАММА Burkholderia cenocepacia 370
© 2015 г. В. А. Плюта1' 2, В. А. Липасова1, О. А. Кокшарова1- 3, М. А. Веселова1, А. Е. Кузнецов2, И. А. Хмель1
Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва 123182
e-mail: khmel@img.ras.ru 2Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва 125047 3Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва 119899
Поступила в редакцию 13.10.2014 г.
Для изучения роли Quorum Sensing (QS) регуляции в контроле клеточных процессов Burkholderia cenocepacia 370 в клетки этого штамма была передана плазмида pME6863, содержащая гетерологич-ный ген ацил-гомосеринлактоназы AiiA, деградирующей сигнальные молекулы QS систем N-ацил-гомосеринлактоны (АГЛ). При использовании биосенсоров Chromobacterium violaceum CV026 и Agrobacterium tumefaciens NT1/pZLR4 было показано соответственно отсутствие или уменьшение содержания АГЛ в культуре. Присутствие в клетках B. cenocepacia 370 гена aiiA, клонированного из Bacillus sp. A24, приводило к отсутствию гемолитической активности, снижению внеклеточной про-теолитической активности, ослаблению способности клеток мигрировать по поверхности агаризо-ванной среды (сворминг-миграция, swarming). Не наблюдалось влияния введения гена aiiA на липазную активность, синтез жирных кислот, синтез HCN и образование биопленок. Установлено, что пероксид водорода в субингибиторных или слабо подавляющих рост концентрациях вызывал стимуляцию образования биопленок. Введение гена aiiA в клетки не снимало этого эффекта, но уменьшало его величину.
DOI: 10.7868/S0016675815080068
Бактерии комплекса Burkholderia cepacia, к которому относятся и штаммы B. cenocepacia, обитают в различных экологических нишах — их выделяют из организма людей и животных, почвы, воды, ризосферы растений. Некоторые штаммы B. cepacia, в том числе B. cenocepacia, вызывают внутрибольничные инфекции, в основном у людей, больных кистозным фиброзом (муковисци-дозом), хроническим грануломатозом и у пациентов со сниженным иммунитетом [1, 2]. Известно, что бактерии этого комплекса обладают системами QS регуляции. QS системы включают низкомолекулярные сигнальные молекулы различной химической природы и регуляторные белки, с которыми взаимодействуют сигнальные молекулы. При повышении плотности популяции бактерий сигнальные молекулы накапливаются до необходимого порогового значения, что может приводить к резкой активации транскрипции (индукции) определенных наборов генов во всей популяции. QS системы играют важную, часто ключевую роль в регуляции различных процессов метаболизма бактерий, они рассматриваются как глобальные факторы экспрессии бактериальных генов [3, 4]. QS системы контролируют такие важнейшие кле-
точные процессы, как патогенез, вызванный болезнетворными бактериями, формирование биопленок, синтез токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, ферментов и др.
Бактерии B. cenocepacia содержат по крайней мере три системы QS регуляции. Две из них — CepI/CepR, CciI/CciR — используют N-ацил-го-мосеринлактоны (АГЛ) в качестве сигнальных молекул. CepI АГЛ-синтаза продуцирует N-окта-ноил-гомосеринлактон (С8-ГЛ) в больших количествах и N-гексаноил-гомосеринлактон (С6-ГЛ) в минорных количествах. CciI АГЛ-синтаза, наоборот, катализирует синтез C6-EH в больших количествах и С8-ГЛ в минорном количестве. АГЛ взаимодействуют с регуляторными белками CepR и CciR. Эти QS системы контролируют различные клеточные функции B. cenocepacia, такие как синтез факторов вирулентности, образование биопленок, миграцию клеток по поверхности сред и др. [5—11]. Кроме того, у этих бактерий была обнаружена еще одна QS система, которая функционирует с участием сигнальной молекулы иной природы — BDSF (cis-2-dodecenoic acid) [6, 7, 10, 12]. B. cenocepacia синтезирует также 2-геп-
Таблица 1. Штаммы бактерий, использованные в работе
Штаммы бактерий Характеристика штаммов Источник
Burkholderia cenocepacia 370 Клинический изолят Коллекция НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН
Chromobacterium violaceum (CV026) Биосенсор для определения АГЛ. Продукция виолацеина. £шг штьТп5 Ы§г cviI::Tn5xylE Кшг [17]
Agrobacterium tumefaciens NT1/pZLR4 Биосенсор для определения АГЛ, Gmг СЬГ [18]
E. coli S17-1/pME6863 817-1(1-р1г), несет плазмиду рМЕ6863, содержащую клонированный ген aiiA, Тсг Л.С. Чернин, Израиль
Burkholderia cenocepacia 370/pME6863 Штамм несет плазмиду рМЕ6863, содержащую клонированный ген aiiA, Тсг Данная работа
тил-4-хинолон (HHQ) — соединение, которое может участвовать в клеточной коммуникации [13].
Таким образом, в клетках B. cenocepacia функционируют несколько QS систем, которые обеспечивают тонкую регуляцию метаболизма бактерий в различных условиях обитания.
В настоящей работе с целью изучения роли QS в регуляции клеточных процессов B. cenocepacia в клетки клинического изолята B. cenocepacia 370 (выделен и идентифицирован в Государственном научном центре по антибиотикам и НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) была введена плазмида широкого спектра хозяев pMB6863, содержащая гетерологичный ген aiiA, клонированный из Bacillus sp. A24. Этот ген кодировал фермент гомосеринлактоназу AiiA, деградирующую АГЛ [14]. Введение гена гомосе-ринлактоназы приводит к инактивации АГЛ и в результате подавляет функционирование QS систем, нарушая регуляцию клеточных процессов, зависящих от QS. Этот подход представляется весьма перспективным для изучения регулятор-ной роли QS систем, однако он был использован только для нескольких бактерий. Многие вопросы, связанные с действием гомосеринлактоназ в клетках, остаются неизученными.
Штамм B. cenocepacia 370 обнаруживал потенциальные факторы патогенности: гемолитическую активность, внеклеточную протеазную активность, липазную активность, а также хитино-литическую активность, но был слабо вирулентен при испытаниях на мышах [15]. Введение в клетки штамма плазмиды pMB6863 приводило к резкому уменьшению АГЛ в культуре и влияло на ряд свойств бактерии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы бактерий и условия культивирования. Штаммы бактерий, использованные в работе,
приведены в табл. 1. Для выращивания культур бактерий использовали среды Luria Broth (LB), агаризованный (1.5%) LB (LA) и M9 c необходимыми добавками [16]. Выращивание культур бактерий проводили при температуре 30°C. Антибиотики отечественного производства использовали в концентрациях (мкг/мл): ампициллин — 100—200; канамицин — 100; гентамицин — 40. Тетрациклин гидрохлорид (Sigma) использовали в концентрации 20 мкг/мл.
Определение продукции АГЛ. Для определения продукции АГЛ использовали два биосенсора. Первый сенсор Chromobacterium violaceum CV026 высевали штрихами на поверхность среды LA, пересекали их штрихами тестируемых культур, инкубировали 24—48 ч при 30°С. В случае, когда штамм продуцировал АГЛ, наблюдали окрашивание индикаторного штамма (CV026) в фиолетовый цвет. Интенсивность окраски оценивали визуально [17].
Второй биосенсор Agrobacterium tumefaciens NT1/pZLR4 выращивали на среде LB с добавлением ампициллина и гентамицина в течение ночи при 30°С. Чашку Петри с агаризованной средой М9, содержащей X-Gal (конечная концентрация 80 мкг/мл), заливали 3 мл агаризованной (0.6% агара) среды М9 с добавлением 0.5 мл ночной культуры A. tumefaciens NT1/pZLR4. Тестируемые на способность к продукции АГЛ штаммы высевали уколами на поверхность агаризованной среды после ее застывания или добавляли жидкую ночную культуру в лунки в агаризованной среде, инкубировали при 30°С 24—48 ч. О синтезе АГЛ тестируемыми штаммами судили по появлению голубых зон гидролиза X-Gal [18].
Перенос плазмиды pME6863 в клетки B. cenocepacia 370 выполняли по [14] с небольшими модификациями. Плазмиду передавали из E. coli S17-1 конъюгацией с селекцией на среде LA с тетрациклин гидрохлоридом и ампициллином. Ре-
зистентность клеток к тетрациклин гидрохлориду определялась плазмидой, ампициллин добавлялся в среду для удаления штамма донора E. coli S17-1, содержащего плазмиду pME6863. Присутствие гена aiiA в штамме B. cenocepacia 370, несущем плазмиду pME6863, было подтверждено ПЦР с использованием специфических праймеров для этого гена (подобраны по последовательности гена aiiA, AF397400): AIIA-F 5'-TTCGTCCCAG-CAGGTCGTT-3' и AIIA-R5'-GATGCCCTGGAG-TATGGCCT-3'.
Режим ПЦР: 1 цикл 94°С - 3 мин, 62°С -2 мин, 72°С — 2 мин, затем 30 циклов 94°С — 10 с, 62°С — 10 с, 72°С — 20 с, после чего 1 цикл 72°С — 5 мин. После амплификации пробы анализировались с помощью электрофореза в агарозном геле.
Определение ферментативных активностей
Определение внеклеточной протеолитической активности. Клетки тестируемых штаммов высевали уколом на агаризованную среду LA с молоком (молоко, содержащее 0.5% жира, составляло 1/3 часть от общего объема среды), инкубировали 48 ч при 30°С. В случае, когда штаммы обладали внеклеточной протеолитической активностью, вокруг колоний наблюдались зоны ферментативного гидролиза казеина молока (зоны просветления). О величине ферментативной активности судили по радиусу зон гидролиза.
Определение липазной активности проводили, как описано [19]. Клетки тестируемых штаммов высевали уколом на среду LA с добавлением твин-20 (1%) и CaCl2 (0.01%). Инкубировали 7 сут при 30°С. В случае, когда штаммы обладали ли-пазной активностью, вокруг колоний наблюдали мутные зоны (твин-20 расщеплялся с образованием лауриновой кислоты, что приводило к образованию в присутствии кальция нерастворимой соли этой кислоты). О ферментативной активности судили по радиусу непрозрачных зон вокруг колоний и степени помутнения среды в пределах непрозрачной зоны.
Определение гемолитической активности. Клетки тестируемых штаммов высевали уколом на кровяной агар, инкубировали 7 сут при 28°C. О гемолитической активности судили по прозрачным зонам гемолиза вокруг колоний.
Определение образования биоп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.