^^^^^^^^^^^^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^
СТАТЬИ
581.1
ЭФФЕКТИВНАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ И СТАБИЛЬНАЯ АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РАЙГРАСА МНОГОЛЕТНЕГО
© 2007 г. Ю. Е. By*,**, Ц. Ю. Чен*, С. X. Куи*, X. Чен*, Ц. Чен*, X. Ч. Ван*
* Колледж биологических наук, Китайский сельскохозяйственный университет, Пекин, Китай ** Колледж естественных наук, Шаньдунский сельскохозяйственный университет, Тайюань, Китай
Поступила в редакцию 30.05.2006 г.
Мы использовали технологию переноса генов для усовершенствования растений райграса многолетнего (Lolium perenne L.), достигнув эффективной регенерации и успешной агробактериальной трансформации геном bar, кодирующим фосфинотрицин ацетилтрансферазу. Для оптимизации условий регенерации мы сравнили действие различных комбинаций четырех регуляторов роста на интактные семена шести сортов газонного райграса, источника зрелых зародышей. Все семена могли образовывать каллус и регенерировать новые растения. Самую высокую частоту каллусообра-зования наблюдали при культивировании семян на МС-среде, содержавшей 9 мг/л 2,4-Д и не содержавшей БАП. Лучше всего образовывался каллус на семенах сорта TopGun (в 96% случаев) частота регенерации также была наивысшей у этого сорта (48.9%). При оптимальных для регенерации условиях эмбриогенные каллусы трансформировали штаммом LBA4404 Agrobacterium, содержавшим плазмиду pCAMBIA3301. После отбора потенциально трансформированных каллусов мы получили 22 регенерированных трансгенных растения, устойчивых к гербициду фосфинотрицину. Трансген-ность ряда регенерантов была подтверждена полимеразной цепной реакцией, гибридизацией по Са-узерну и экспрессией GUS. Два испытанных трансгенных растения обнаружили устойчивость к гербициду. Мы показали, что эмбриогенные каллусы, образовавшиеся из зрелых семян, можно прямо использовать для эффективной регенерации райграса многолетнего и его трансформации, и этот протокол можно применять для генно-инженерного получения растений, устойчивых к гербицидам.
Lolium perenne - Agrobacterium tumefaciens - эффективная регенерация - стабильная трансформация - устойчивость к гербициду - фосфинотрицин ацетилтрансфераза
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 4, с. 590-596
УДК
ВВЕДЕНИЕ
Райграс многолетний (Lolium perenne L.) - диплоидное агрономически важное многолетнее однодольное растение, произрастающее в зонах умеренного климата и являющееся кормовым пастбищным и газонным злаком. В последнее время для ускорения роста и повышения урожая многих культур успешно применяют подходы биотехнологии. Появилось несколько сообщений об использовании генетической трансформации райграса многолетнего в рамках программ по его селекции с целью увеличения его генетических ресурсов и улучшения агрономических качеств
Сокращения: АС - ацетосирингон; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ФТ - фосфинотрицин; 35SCaMV - 35S промотор вируса мозаики цветной капусты (от cauliflower mosaic virus).
Адрес для корреспонденции: X.C. Wang. National Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, College of Biological Sciences, China Agricultural University, Yuanmingyuan Xi Lu 2, Haidian, Beijing, 100094, China. Fax: 86-10-62733450; e-mail: xcwang@cau.edu.cn
[1-4]. Однако главным препятствием для использования технологий переноса генов в райграс многолетний остается отсутствие высокоэффективных процедур его трансформации и регенерации.
Задачами данного исследования была разработка эффективной системы для культивирования тканей райграса многолетнего, полученных из зрелых семян, и проведение их агробактери-альной трансформации и регенерации растений. Для повышения устойчивости этого растения к гербицидам мы ввели в него ген фосфинотрицин ацетилтрансферазы (bar).
МЕТОДИКА
Индукция каллуса и регенерация. Семена 6 сортов райграса многолетнего (Lolium perenne L.): TopGun, Sakini, Calibra, Wizard, Premier и Pickwick, были получены из Института фуражных и газонных трав Китайской академии сельского хозяйства. Семена стерилизовали в 0.1%-ной HgCl2 в течение 20 мин и затем в 70%-ном этаноле в течение 5 мин. Их споласкивали 3-4 раза дистиллиро-
ванной водой и инкубировали на среде для индукции образования каллусов в темноте при 24 ± 1°C. Эта среда содержала МС соли, 30 г/л мальтозы и следующие добавки: 5 мг/л 2,4-Д; 5 мг/л 2,4-Д + + 0.1 мг/л БАП; 9 мг/л 2,4-Д; или 9 мг/л 2,4-Д + + 0.1 мг/л БАП. Белые побеги и корни отбраковывали. Через 4 нед. каллусы отделяли и культивировали на МС-среде, содержавшей 3 мг/л 2,4-Д и 30 г/л мальтозы, в темноте в течение 4-12 нед. с пересадкой каждые 2 нед. Эмбриогенные каллусы переносили на среду для дифференциации (МС + 0.1 мг/л 2,4-Д + 0.1 мг/л БАП + 30 г/л сахарозы) и освещали их в течение 16 ч в сутки светом умеренной интенсивности (1 клк). Регенерировавшие зеленые побеги переносили на среду для корнеобразования (МС + 20 г/л сахарозы + регуляторы роста). Затем побеги освещали более интенсивно (5 клк). Все среды были твердыми благодаря добавке к ним 0.8%-ного фитагеля ("Сигма", США). Перед автоклавированием сред при 121°C и 0.15 МПа в течение 20 мин подводили рН до 5.8.
Агробактериальная трансформация. Для трансформации мы использовали штамм LBA4404 Agro-bacterium и вектор pCAMBIA3301 для экспрессии в растении, любезно предоставленные проф. G.Y. Wang. Гены GUS и bar (ген фосфотрицин ацетилтрансферазы) находились под контролем 35SCaMV промотора, а терминальная область содержала сигнал полиаденилирования гена нопа-линсинтетазы (Nos, рис. 1). Рекомбинантный вектор встраивали в растения райграса многолетнего. Мы отбирали колонии, содержавшие плазмиду, переносили их на 5 мл среды YEB (1 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л бычьего экстракта, 5 г/л пептона, 5 г/л сахарозы, 0.5 г/л MgSO4 ■ 7H2O, рН 7.0), содержавшей 100 мг/л канамицина, и инкубировали при 27-29°C при помешивании в течение ночи. Затем бактерии переносили на 100 мл среды YEB, содержавшей 200 мкМ ацетосирингон (АС), и инкубировали 7-8 ч, пока оптическая плотность суспензии Agrobacterium не достигала 0.5-0.8. Бактерии осаждали центрифугированием при 10000 g в течение 1 мин, ресуспендировали их в жидкой МС-среде, содержавшей 3%-ную сахарозу и 200 мкМ АС, рН 5.2, разбавляя до оптической плотности 0.5-1.0. Мы отбирали эмбриогенные каллусы, культивировали их в течение 12 ч на среде с 0.4 М маннитом, а затем погружали в суспензию агробактерий на 30-40 мин в темноте. Избыток бактерий на каллусе удаляли стерильной фильтровальной бумагой. Затем каллусы на 3 дня переносили на среду для совместного культивирования (среда для культивирования с 200 мкМ АС) при 24°C в темноте. После этого инфицированные каллусы промывали 3-4 раза стерильной водой, содержавшей 200 мг/л цефотаксима натрия, и переносили на селективную среду, содержавшую различные концентрации селективных аген-
CaMV35Spoly-A CaMV35S промотр
pCAMBIA3301 5074 т.п.н.
Рис. 1. Линейная карта конструкции Т-ДНК pCAMBIA3301 для трансформации злаков. Гены bar и gus находятся под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Левая граница Т-ДНК - левый фланг pCAMBIA3301; CaMV35Spoly-A - терминатор CaMV35S; bar - ген, кодирующий фос-финотрицин ацетилтрансферазу; CaMV35S промотор -35S промотор вируса мозаики цветной капусты; gus -ген Р-глюкуронидазы; Nos poly-A - терминатор нопа-линсинтазы; правая граница Т-ДНК - правый фланг pCAMBIA3301; BamHI - рестриктаза, узнающая сайт GGATCC, создающая липкие концы (организм - Bacillus amyloliquefaciens H); SacII - рестриктаза, узнающая сайт CCGCGG (организм - Streptomyces achromo-genes); BglII - рестриктаза, узнающая сайт AGATCT (организм - Bacillus globigii); BstEII - рестриктаза, узнающая сайт GGTNACC (организм - Bacillus stearo-thermophilus).
тов и антибиотиков, т.е. на среду для регенерации, содержавшую 5-10 мг/л L-фосфотрицина (ФТ) и 200 мг/л цефотаксима. Пересадки проводили каждые две недели. Концентрация ФТ была 5 мг/л в первые две недели, а затем ее повышали до 10 мг/л. Примерно через 6 нед. выжившие побеги переносили на среду для укоренения. Укоренившиеся побеги сначала адаптировали в течение 2-3 дней, открывая крышки контейнеров, а затем высаживали в почву.
Анализ трансгенных растений. Мы гистохими-чески оценивали экспрессию GUS на срезах листьев и корней по Jefferson с соавт. [5]. В каллусах, отобранных после двухнедельного культивирования на селективной среде, определяли транзиент-ную экспрессию. Экспланты погружали в буфер для определения активности GUS и инкубировали при 37°C в течение ночи. Затем их фиксировали в 95%-ном этаноле. После окрашивания определяли экспрессию GUSAint по размеру голубого пятна на белом фоне.
Для проверки встраивания гена bar в геномную ДНК мы проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для предполагаемых трансформированных линий с использованием следующих праймеров: 5'-GCG GTC TGC ACC ATC GTC-3' и 5'-GTA CCG GCA GGC TGA AGT CCA-3'. 100 нг ДНК, экстрагированной из листьев, использовали в ПЦР, проведенной с Taq ДНК-полимеразой в объеме 25 мкл. ПЦР проводили в следующем режиме: 5 мин при 95°C, 0.5 мин при 94°C, 0.5 мин при 63°C, 0.5 мин при 72°C и 2 мин при 72°C - все-
Таблица 1. Влияние разных концентраций 2,4-Д и БАП на частоту индукции каллусов (%)
2,4-Д + БАП, мг/л Сорт
TopGun Sakini Calibra Wizard Premier Pickwick
5 + 0 66.6 ± 2.9 67.8 ± 2.0 71.5 ± 2.5 63.2 ± 1.7 20.0 ± 3.0 43.4 ± 2.1
5 + 0.1 65.9 ± 2.1 61.3 ± 1.5 63.2 ± 1.9 62.7 ± 2.1 20.3 ± 0.8 43.8 ± 1.2
9 + 0 92.6 ± 2.3 74.1 ± 2.0 81.1 ± 2.0 82.8 ± 2.4 30.2 ± 1.2 66.2 ± 1.6
9 + 0.1 74.5 ± 2.1 58.3 ± 1.4 52.0 ± 1.2 82.2 ± 2.2 28.7 ± 0.9 63.1 ± 1.6
Примечание. Каждая цифра - среднее значение и стандартная ошибка (п = 3).
го 30 циклов. Продукты амплификации подвергали электрофорезу в 1%-ном (вес/объем) агароз-ном геле. Для Саузерн-блот-анализа 20 мкг геномной ДНК, экстрагированной из листьев предполагаемых трансформированных линий и из растений дикого типа, расщепляли BamH ре-стриктазой и подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле при 45 В в течение 16-18 ч. После переноса на нейлоновую мембрану проводили их гибридизацию с зондом, специфичным для гена bar, меченным а
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.