ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИИ, 2009, том 56, № 4, с. 603-608
ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ
УДК 581.1
ЭФФЕКТИВНАЯ СИСТЕМА РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ КРАСНО-ЧЕРЕШКОВОЙ СВЕКЛЫ In Vitro
© 2009 г. Ц. Л. Су*, Я. X. Ce**, X. Рш*, С. Ху*, Ч. И. Ван*, С. Ю. Ван*
*Институт клеточной биологии, Школа естественных наук, Ланъчжоуский университет, Ланьчжоу, Китай **Сианьский институт садоводства, Сиань, Китай Поступила в редакцию 09.04.2008 г.
Разработана эффективная система регенерации in vitro красно-черешковой свеклы, разновидности листовой свеклы мангольд (Beta vulgaris L. cv. cicla L.), широко используемой в декоративном садоводстве и для получения бетацианина. Кончики побегов и экспланты из черешков, полученные от стерильных проростков, выращенных на МС-среде, содержавшей 15 мг/л БАП и 3% сахарозу при температуре 1б°С в течение 30 дней, могут формировать соответственно в 81 и 17% случаев полупрозрачные бугристые (ПБ) каллусы. Все ПБ каллусы при тех же условиях культивирования формировали придаточные побеги. Каждый эксплант с ПБ каллусом давал в среднем 8.65 побегов. Обнаружено, что предварительное культивирование стерильных проростков красно-черешковой свеклы и дальнейшее выращивание эксплантов при пониженной температуре (16°С) было существенным для индуцирования ПБ каллуса и формирования придаточных почек. Для укоренения регенерировавших побегов оптимальной оказалась разбавленная вдвое среда МС с содержанием сахарозы 10 г/л. После пересадки в почву растения хорошо росли и могли цвести и плодоносить. Результаты гистологического анализа показали, что ПБ каллус образовывался из клеток проводящей ткани листового черешка, а придаточные побеги формировались в результате органогенеза. Обсуждаются факторы, влияющие на микроклональное размножение свеклы в условиях in vitro.
Ключевые слова: Beta vulgaris - придаточные почки - каллусогенез - микроклональное размножение in vitro - образование побегов
ВВЕДЕНИЕ
Красно-черешковая свекла с большими темно-красными листьями принадлежит к одной из нескольких разновидностей листовой свеклы -мангольд (Beta vulgaris L. cv. cicla L.). Благодаря своим красивым красным листьям это растение широко используется при украшении цветников и для производства бетацианина, натурального красителя, применяемого в пищевой промышленности [1, 2]. Кроме того, из-за большей устойчивости к почвенному засолению [3] и пониженным температурам [4] это растение рассматривают в качестве потенциального источника гермоплаз-мы для улучшения свойств сахарной свеклы (В. vulgaris L.), промышленно важной сахаросо-держащей культуры. Однако для исключения возможности переопыления разных видов при
Сокращения: КП - красный плотный, КР - красный рыхлый, ПБ - полупрозрачный бугристый; БП - белый плотный; БР - белый рыхлый; TIBA - 2,3,5-трииодбензойная кислота (от triiodbenzoic acid).
Адрес для корреспонденции: Chong-ying Wang. Institute of Cell Biology, School of Life Science, Lanzhou University, Lanzhou 730000, P. R. China. Fax: 086-0931-89-12561; e-mail: wangcy@ lzu.edu.cn
выращивании красно-черешковой свеклы обычно требуется пространственная обособленность, а процент всхожести ее семян не очень высок. Все это затрудняет сохранение гермоплазмы и размножение этой культуры. Для преодоления этих ограничений, желательно разработать технологию эффективного микроклонального размножения in vitro растений вида В. vulgaris L. [5-7]. По нашим сведениям, знаний о регенерации в условиях in vitro красно-черешковой свеклы и других разновидностей В. vulgaris L. cv. cicla недостаточно. Кроме того, регенерация растений рода Beta in vitro не проста [7]. Таким образом, возникает необходимость поиска новых методов, позволяющих преодолеть эти препятствия.
Целью нашего исследования была разработка эффективной системы микроклонального размножения in vitro, необходимой для размножения и генетической трансформации этого растения.
МЕТОДИКА
Растительный материал и условия роста. В настоящей работе использовали семена красно-че-
Таблица 1. Морфологические особенности каллусов, индуцируемых при разных температурах и различных концентрациях БАП
БАП, мг/л Типы образованного каллуса*
25°С 16°С
0 КП, КР, БП, БР КП
0.1 КП, КР, БП, БР КП
1.0 КП, КР, БП, БР КП
2.0 КП, КР, БП, БР КП, КР, БП, БР
5.0 КП, КР, БП, БР КР,БР
10.0 КР,БР КП, КР, БП, БР
15.0 КР,БР КП, КР, БП, БР, ПБ
20.0 КР,БР КП, КР, БП, БР
Примечание. КР - красный плотный; КР - красный рыхлый; БП - белый плотный; БР - белый рыхлый; ПБ - полупрозрачный бугристый.
* Все каллусы были получены из кончиков побегов, черешковых, листовых и гипокотильных эксплантов.
решковой свеклы (Beta vulgaris L. cv. cicla L.), купленные в местной компании. Сначала для обеспечения всхожести их в течение 15 мин вымачивали в концентрированной серной кислоте. После тщательного промывания проточной водой, семена 1 мин стерилизовали 70% спиртом и затем 10 мин 0.1% хлоридом ртути. Потом их переносили на безгормональную МС-среду [8] для прорастания при 25°С. Через неделю стерильные проростки переносили на среду МС, содержавшую БАП в концентрации 2 или 15 мг/л для предварительного культивирования при 16°С.
Образование каллуса и придаточных почек.
Кончики побегов, гипокотили, черешковые, семядольные и листовые экспланты, взятые от 30-дневных стерильных проростков без предварительной обработки бАп и от проростков, культивируемых на среде, содержавшей БАП, помещали на среду МС с различными концентрациями 2,4-Д (0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 и 3 мг/л), БАП (0.1, 1, 2, 5, 10, 15 и 20 мг/л) и 2,3,5-трииод-бензойной кислоты (TIBA, ингибитор транспорта ауксина, 1 и 2 мг/л) для индуцирования каллусоге-неза при температурах 16 и 25°С. Примерно через 4 нед. сформировались каллус и придаточные почки, и почки перенесли на среду МС с 15 мг/л БАП для образования побегов и их роста при 16°С. В каждом опыте использовали примерно по 60 эксплантов, опыты проводили в двух повтор-ностях. Все среды содержали 3% сахарозы.
Индукция образования корней. Примерно 2-сантиметровые регенеранты помещали на среду МС с половинной долей азота, содержавшую различные концентрации сахарозы (0, 10 и 30 г/л), с до-
бавлением НУК (0.3 мг/л) или без него, и выращивали при 16°С.
Все вышеуказанные среды были приготовлены на 0.7% агаре (Difco Bacto agar); рН сред доводили раствором КОН до 5.8; среды автоклавиро-вали при 120°С в течение 20 мин. Все культуры выращивали в условиях освещения холодным белым флуоресцентным светом 24 мкмоль/(м2 с) при фотопериоде 14 ч.
Адаптация и пересадка регенерировавших растений. С появлением у полученных регенеран-тов 3-4 корней температуру выращивания поднимали с 16 до 25°С на 2 дня для адаптации, после чего растения культивировали на водонасыщен-ном вермикулите, покрытом полимерной пленкой, которую через неделю убрали.
Гистологические наблюдения. Для изучения происхождения полупрозрачного бугристого (ПБ) каллуса черешковые экспланты с такими каллусами фиксировали смесью 70% этанол : формальдегид : уксусная кислота (90 : 5 : 5), заливали парафином, разрезали микротомом АО 820 ("American Optical", США), окрашивали 0.5% водным гематоксилином, анализировали и фотографировали срезы под микроскопом Olympus.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние типов эксплантов и подготовки стерильных проростков на каллусогенез и образование побегов
Хорошо известно, что происхождение эксплантов играет ключевую роль в культуре тканей свеклы [5]. В связи с этим, для поиска оптимальных эксплантов в работе использовали пять различных видов эксплантов (семядоли, листья, гипокотили, черешки и кончики побегов). Все виды эксплантов, взятые от стерильных проростков, предварительно обработанных в течение 30 дней БАП или без обработки, после 4-недельного культивирования на средах, содержавших различные концентрации БАп, 2,4-Д и TIBA образовывали различные типы каллуса: красный плотный (КП), красный рыхлый (КР), белый плотный (БП), и/или белый рыхлый (БР) каллусы. Все эти каллусы не были способны к дифференцировке почек ни при 25, ни при 16°С. Но при культивировании этих эксплантов на среде с 15.0 мг/л БАп при 16°С они могли формировать также ПБ-кал-лус, который был способен к дифференцировке в придаточные почки после 2-3 нед. культивирования (табл. 1). Однако семядольные экспланты не образовывали ПБ каллусы, приводящие к регенерации. Из пяти использованных видов эксплантов кончики побегов были самыми эффективными эксплантами в индуцировании ПБ каллуса (81.02%); черешки также были достаточно эффективны (17.33%) (табл. 2). Таким образом, для
Таблица 2. Влияние типов эксплантов на индукцию ПБ каллуса и формирование придаточных почек
Тип экспланта Общее число эксплантов Образовавшиеся ПБ каллусыа, % Почки, сформировавшиеся из ПБ каллуса®, % Число почек на один эксплант
Листь 207 2.44 ± 0.22 100 4.25 ± 2.28
Листс 163 6.21 ± 2.53 100 4.50 ± 2.06
Черешокь 152 2.80 ± 0.35 100 8.40 ± 3.14
Черешок 228 17.33 ± 9.15 100 9.25 ± 2.95
Кончик побегаь 139 69.23 ± 4.95 100 8.36 ± 2.01
Кончик побегаc 158 81.02 ± 0.76 100 8.60 ± 1.85
Гипокотильь 154 0.90 ± 1.27 100 2.33 ± 0.47
а Среда МС, содержавшая 15 мг/л БАП, при 16°С.
ь Экспланты от стерильных проростков, предварительно культивируемых в течение 30 дней на среде, содержавшей 2.0 мг/л БАП. с Экспланты от стерильных проростков, предварительно культивируемых в течение 30 дней на среде, содержавшей 15 мг/л БАП.
образования ПБ каллуса и появления придаточных почек у красно-черешковой свеклы оптимальными оказались экспланты из кончиков побегов. Такая же особенность была обнаружена и у сахарной свеклы [9, 10].
Как было описано выше, побеговые, гипоко-тильные, черешковые и листовые экспланты, полученные из стерильных проростков, которые предварительно обрабатывали БАП, образовывали ПБ каллус. Однако в случае идентичных эксплантов из стерильных проростков без предварительной обработки БАП при культивировании на аналогичных средах образования побегов не происходило. Таким образом, подготовка стерильных проростков путем их выращивания на среде, содержавшей бАп, имела существенное значение для индукции формирования у красно-черешк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.