научная статья по теме ЭФФЕКТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ ТОПОЛЯ ИЗ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПЫЛЬНИКОВ И ИХ АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ Биология

Текст научной статьи на тему «ЭФФЕКТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ ТОПОЛЯ ИЗ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПЫЛЬНИКОВ И ИХ АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 4, с. 629-633

= МЕТОДИКА =

УДК 581.1

ЭФФЕКТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ ТОПОЛЯ ИЗ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПЫЛЬНИКОВ И ИХ АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ

© 2007 г. Г. 3. Цу*, Г.Ф. Лью**, Й. С. Ван**, Дж. Цзян**, М. X. Ван*

* Национальный университет Канвон, Чхунчхон, Южная Корея ** Северо-восточный университет леса, Харбин, Китай Поступила в редакцию 19.05.2006 г.

Предложена методика агробактериальной трансформации гаплоидных растений гибридного тополя Populus simonii х P. nigra в культуре in vitro. Пыльники вводили в культуру и получали каллус, на котором затем регенерировали гаплоидные растения. Регенерированные растения размножали в культуре in vitro с использованием листовых эксплантов. В полученных растениях отмечали наличие как гаплоидных, так и диплоидных клеток, что указывало на удвоение числа хромосом, спонтанно происходившее в гаплоидных клетках. Полученные гаплоидные растения трансформировали геном nptll путем заражения листовых эксплантов Agrobacterium tumefaciens. В результате трансформации было получено пять независимых линий устойчивых к канамицину. Эффективность трансформации составила 6%. Полимеразная цепная реакция выявила присутствие гена nptll в растениях пяти полученных линий, которые оставались гаплоидными. Таким образом, в данной работе предложена эффективная методика трансформации гаплоидных растений тополя в культуре in vitro.

Populus simonii х P. nigra - Agrobacterium tumefaciens - пыльники - гаплоиды - трансформация

ВВЕДЕНИЕ

Ряд разработанных в настоящее время методик позволяет вводить в растения чужеродные гены, определяющие их важные свойства. По сравнению с методами традиционной селекции использование трансгенных растений значительно сокращает селекционный цикл, что особенно важно для древесных растений. Первое поколение трансгенных растений (Т0) обычно гетерозиготно, что значительно усложняет процесс селекции. Этих трудностей можно, тем не менее, избежать, если использовать для трансформации гаплоидные растения.

Гаплоидные растения даже на стадии спорофита имеют гаметофитный, т.е. одинарный, набор хромосом, поэтому их применение имеет большое значение при изучении мутаций и для получения гомозиготных растений. И гаплоидные, и гомозиготные диплоидные растения довольно сложно получить традиционными методами. Значительный прогресс в получении гаплоидных растений для селекционных целей был достигнут благодаря разработке методов культи-

Сокращение: ПЦР - полимеразная цепная реакция. Адрес для корреспонденции: M.H. Wang. School of Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea. Fax: +82-33-241-6480; e-mail: mhwang@kangwon.ac.kr

впрованпя in vitro изолированных пыльников, пыльцы и неоплодотворенных семяпочек. В 1967 г. было получено первое гаплоидное растение Nico-tiana tabacum [1]. С тех пор методики получения таких растений были разработаны для различных видов травянистых и древесных растений, таких как Oryza sativa, Setaria italica, Zea mays, Aesculus hippocastanum [2-5].

Гибридный тополь Populus simonii X P. nigra, полученный путем скрещивания женского растения P. simonii и мужского P. nigra, широко известен и популярен на севере Китая, поскольку проявляет холодостойкость и устойчивость к вредителям и болезням. В данной работе этот вид тополя использовали для разработки методики получения гаплоидных растений и процедуры их трансформации в культуре in vitro.

МЕТОДИКА

Индукция образования и размножение гаплоидных растений. Здоровые ветви с цветочными почками срезали с растений тополя Populus simonii X P. nigra и помещали в воду при комнатной температуре. Развитие микроспор наблюдали под микроскопом. По достижении мононуклеарной стадии почки изолировали, освобождали от наружных тканей и стерилизовали 70%-ным этанолом в течение 30 с, затем 2%-ным раствором NaClO в течение 10 мин. После тщательной отмывки в

Правая граница

Левая граница

<

NOS-P

nptll

Nos-pA

Camv35s-P

betA

Nos-t

Рис. 1. Конструкция бинарного вектора pRoklI.

стерильной воде пыльники выделяли и высаживали в чашки Петри (90 х 15 мм) на агаризован-ную среду МС [6], содержавшую различные сочетания регуляторов роста. Каллусы, полученные из пыльников, переносили на среду для дифференциации для индукции образования адвентивных побегов. Для выбора оптимального состава среды использовали среды МС, МН (среда, содержавшая макроэлементы по МС и микроэлементы по Н [1]) и ^РМ [7]. Побеги длиной около 1 см отделяли и переносили на среду для укоренения, содержавшую 0.2 мг/л НУК. Через 20-25 суток укорененные побеги высаживали в почву. В данной работе все этапы культивирования проводили при 25°С и 16-часовом фотопериоде. Среда для индукции каллуса из пыльников содержала 30 г/л сахарозы, все остальные среды - 20 г/л сахарозы. Все среды содержали 0.8% агара. Все фитогормо-ны и антибиотики были получены от фирмы "Duchefa" (Нидерланды).

Определение плоидности. Апексы стерильных побегов выдерживали при 4°С в течение суток, затем фиксировали в жидкости Карнуа в течение

Таблица 1. Влияние различных сочетаний регуляторов роста на число каллусов

Концентрация, мг/л Число каллусов

2,4-Д кинетин

1 0.5 3

1 1 3

1 2 0

1 3 3

2 0.5 1

2 1 0

2 2 35

2 3 1

4 0.5 2

4 1 15

4 2 17

4 3 4

6 0.5 8

6 1 2

6 2 8

6 3 9

Примечание. Пыльники культивировали на среде МС в течение 30 суток. Для каждого варианта п = 100 пыльников.

24 ч. Фиксированные ткани подвергали гидролизу в 1 N HCl в течение 10 мин и промывали дистиллированной водой. После окраски ацетокар-мином готовили давленые препараты. Подсчет хромосом проводили не менее, чем у 15 метафаз-ных клеток каждой линии.

Трансформация гаплоидных растенип. Для

трансформации использовали Agrobacterium tumefa-ciens, штамм EHA 105 со встроенной плазмидой pRokII (рис. 1), несущей ген неомицинфосфо-трансферазы II (nptll) под контролем промотора агробактериального гена нопалинсинтетазы NOS и ген бетаинальдегиддегидрогеназы (betA) под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты 35S. Трансформацию проводили путем заражения агробактерией изолированных листовых дисков [8]. Перед трансформацией определяли токсичность канамицина. Для этого изолированные листовые диски помещали на среду для дифференциации, содержавшую 20, 30, 40, 50, 60, 70 и 80 мг/л канамицина. Подсчитывали число некрозов и регенерированных побегов. Для трансформации листовые диски погружали в бактериальную суспензию на 5 мин, затем проводили совместное культивирование в темноте при 25°С в течение трех суток. После этого экспланты переносили на селективную среду с регуляторами роста и канамицином, содержавшую также 500 мг/л цефотаксима. ДНК выделяли из молодых листьев предполагаемо трансгенных и контрольных растений, растущих в почве. Для анализа гена betA с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали праймеры 5'-ATCGATTCTAGAC-CCGGGATGCAATTTGACTACATCATTATT-3' и 5'-GATATCGAGCTCAACTCTCAATTCTGATCGG-TTCCTGC-3'. ПЦР проводили по следующей программе: после начальной денатурации (2 мин при 94°С) проводили 30 циклов (30 с при 94°С, 30 с при 65°С, 2 мин при 72°С), затем синтез 10 мин при 72°С. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Индукция образования и размножение гаплоидных растений

В данной работе для индукции каллуса из пыльников тополя использовали комбинацию 2,4-Д и кинетина. Через неделю после инокуляции часть пыльцевых зерен начала быстрый рост, и через месяц из некоторых пыльников развился желтовато-зеленый каллус (рис. 2а). В табл. 1 по-

Л П

« Ч V

и

-И1

К, Д>

Рис. 2. Индукция каллуса из пыльников тополя и образование гаплоидных растений.

а - каллус, индуцированный из пыльников, культивируемых на среде МС с 2 мг/л 2,4-Д и 2 мг/л кинетина в течение 4 нед.; б - образование адвентивных побегов на листовых эксплантах после 2 нед. культивирования на среде МН с 0.5 м г/л БАП и 0.05 мг/л НУК; в - проростки на среде МН для укоренения, содержавшей 0.2 м г/л НУК, после 3 нед. культивирования; г - укорененные побеги в оранжерее на 20-е сутки после высадки.

казано влияние регуляторов роста на число образовавшихся каллусов. Оптимальным сочетанием было 2 мг/л 2,4-Д и 2 мг/л кинетина. Также оказалось, что концентрация сахарозы в среде менее 25 г/л ингибировала рост каллуса. В то же время, длительное поддержание пыльников в культуре значительно снижало их жизнеспособность, что выражалось в появлении некрозов коричневого цвета. Развитие адвентивных побегов индуцировали переносом каллусов на среду МС с 0.1 мг/л БАП и 0.05 мг/л НУК. При сравнении влияния состава сред на регенерацию проростков сильные и быстрорастущие проростки развивались на среде МН. На средах WPM и МС из эксплантов развивались единичные слабые, карликовые ростки (дан-

ные не приводятся). Влияние различных регуляторов роста на инициацию и рост побегов на среде МН представлено в табл. 2. При наличии в среде 0.5 мг/л БАП и 0.05 м г/л НУК на листовых насечках развивалось много нормальных, быстрорастущих побегов (рис. 26), поэтому такое сочетание регуляторов роста было признано оптимальным. Побеги около 1 см длиной переносили на среду для укоренения с 0.2 мг/л НУК. Примерно 10 суток спустя развивались придаточные корни (рис. 2в). После 3-дневной акклиматизации с регулируемой влажностью укорененные побеги пересаживали в горшки и переносили в оранжерею (рис. 2г). Исследования показали, что полученные проростки были восприимчивы к грибной

Таблица 2. Влияние различных сочетаний регуляторов роста на инициацию и развитие побегов на листовых эксплантах тополя на среде МН

Концентрация, мг/л

БАП НУК

0.5 0.05

0.5 0.1

1 0.05

1 0.1

Наблюдаемый эффект

множество нормальных, быстрорастущих побегов

каллус в области насечек на листовых дисках, отдельные медленнорастущие побеги кластеры слабых побегов

отдельные нормальные медленнорастущие побеги

H

рУ

&

V

Н

г *

I J

В » г " - -1

? v/Щь X

V ' - *

г

Ъг-L* 7

я*.

S с* "■ Wv.

I 10 мкм

Рис. 3. Цитологические наблюдения гаплоидной клетки в метафазе.

т.п.н.

2.0 — 1.5 —

Рис. 4. ПЦР

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком