ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 3, с. 304-310
УДК 579.6:581.557
ЭФФЕКТИВНОСТЬ БИОПРЕПАРАТОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ СОИ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ГОМОЛОГИЧНЫМ ЛЕКТИНОМ
© 2007 г. Д. М. Сытников, С. Я. Коць, В. К. Даценко
Институт физиологии растений и генетики НАН, Украины, Киев, 03022, e-mail: sytnikov@list.ru
Поступила в редакцию 18.06.2006 г.
Исследовано влияние различных биопрепаратов клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum, модифицированных гомологичным лектином, на вирулентность ризобий, азотфиксирующую активность корневых клубеньков и продуктивность растений сои Glycine max (L.) Merr. Установлено, что внесение гомологичного лектина в бактериальную суспензию при изготовлении жидких биопрепаратов и препаратов на твердом носителе приводит к повышению эффективности симбиоти-ческой системы сои и увеличению продуктивности растения-хозяина. Обсуждается перспективность использования бактериальных препаратов, модифицированных гомологичным лектином.
Загрязнение природной среды при односторонней ориентации на применение высоких доз минеральных азотных удобрений и ограниченность невозобновляемых энергоресурсов, необходимых для их промышленного синтеза, ставят вопрос о более широком использовании биологического азота. Поэтому, одним из основных приемов повышения продуктивности растений и качества урожая при сохранении плодородия почв и без ухудшения экологического состояния окружающей среды является применение биологических препаратов на основе азотфиксирующих микроорганизмов [1]. Использование названных микробных препаратов позволяет регулировать численность и активность полезной микрофлоры в ризосфере возделываемых культур и в значительной степени обеспечивать растения азотом, фиксированным из атмосферы.
Ключевая роль в решении проблемы дефицита полноценного белка принадлежит сое [2], однако в почвах, на которых эта культура выращивается впервые, обычно отсутствуют специфичные для нее клубеньковые бактерии или же их количество незначительно (до 20 ед./г почвы) [3].
Исследования последних лет показали, что внедрение технологий, основанных на биологической фиксации молекулярного азота, дает возможность получать качественное соевое сырье, не содержащее вредных химических соединений, в том числе и нитратов, обогащенное белками, жирами и незаменимыми аминокислотами [4].
Изучение взаимоотношений бобовых растений и клубеньковых бактерий является одним из ключевых звеньев в решении поставленных вопросов. Лектины - белки, обладающие способностью обратимо и избирательно связываться с углеводными частями молекул гликопротеинов и гликолипидов, играют существенную роль в ста-
новлении и дальнейшем функционировании симбиоза. Наряду с другими биологически активными веществами лектины бобовых уже при прорастании семян секретируются во внешнюю среду [5], стимулируя размножение и активное движение к корням почвенных микроорганизмов. Они также оказывают влияние на рост микросимбионтов и синтез ими экзогликанов [6]. В соответствии с имеющимися сегодня представлениями о механизме инокуляции растений ризобиями полисахариды последних являются фактором, который обеспечивает "узнавание" бактериями соответствующего им растения-хозяина путем комплементарного связывания с растительным лектином [7]. Нашими исследованиями также установлено, что в условиях эффективного взаимодействия партнеров симбиоза увеличение лектиновой активности клубеньков сопровождается повышением уровня азотфиксирующей активности [8]. Это позволяет говорить о возможном участии лектина в процессах симбиотической азотфиксации.
Известно, что обработка ризобий лектином специфичного им растения положительно влияет на их вирулентность и конкурентоспособность [9], а также повышает азотфиксирующую активность корневых клубеньков, что связывают с действием лектина на биосинтез нитрогеназы [10] в бактериальной клетке. Как следствие, предварительная инкубация ризобий с гомологичным лектином усиливает ростовые процессы растения и повышает продуктивность симбиоза [11, 12]. В то же время характер влияния данного белка зависит от его концентрации в бактериальной суспензии [11]. Открытым остается вопрос о возможности использования гомологичного лектина при изготовлении бактериальных препаратов.
Цель работы - оценка эффективности биопрепаратов клубеньковых бактерий сои при исполь-
зовании различных носителей и гомологичного лектина, а также изучение их влияния на продуктивность бобово-ризобиального симбиоза.
МЕТОДИКА
Использовали растения сои Glycine max (L.) Merr. районированного сорта Марьяна совместной селекции Института физиологии растений и генетики НАН Украины (ИФРГ), Селекционно-генетического института и Института земледелия УААН. Для инокуляции семян использовали как жидкие биопрепараты, так и препараты на твердом носителе (перлит). Их готовили на основе медленнорастущих клубеньковых бактерий Bradyrhizobi-um japonicum (производственный штамм 6346 из музейной коллекции азотфиксирующих микроорганизмов ИФРГ) с использованием лектина из семян сои, приобретенного в НПК "Лектинотест" (Львов, Украина).
Для приготовления биопрепарата на жидком носителе культуру клубеньковых бактерий выращивали на маннито-дрожжевом агаре [13] при 28°С в течение 8 сут. Биомассу смывали физиологическим раствором (0.9% NaCl), переносили в жидкую маннито-дрожжевую среду [13] и выдерживали при постоянной аэрации и 28°С 4-5 сут до получения титра клеток не менее 1 х 1012 кл./мл. Суспензию бактерий (2 х 107 кл./мл) инкубировали с водными растворами лектина сои в термостате при 28°С в течение 20 ч в соотношении 1 : 1. Конечная концентрация лектина в жидких биопрепаратах с титром клеток 1 х 107 составляла 100 и 300 мкг/мл. Препарат был использован через 10 сут после изготовления.
С целью получения препаратов клубеньковых бактерий с лектином сои на твердом носителе в бактериальную суспензию (60 мл), проинкубированную с различными концентрациями лектина (100 и 300 мкг/мл), дополнительно вносили 5 мл 20%-ного раствора глюкозы, 5 мл 80%-ной патоки и 5 мл 20%-ного кукурузного экстракта (рН 5.0-6.0) в качестве питательных добавок, а также 20 мл стерильной воды. Полученной смесью инокулирова-ли пакеты со стерильным перлитом, после чего культуру ризобий доращивали в течение 10 сут.
Семена сои перед посевом инокулировали жидким биопрепаратом или смывом с бактеризованного перлита. Контролем служили растения, инокулированные бактериальными препаратами без добавления лектина.
Исследования проводили в условиях микрополевого и полевого опытов [14]. Микрополевой опыт был заложен на опытном участке ИФРГ (Киев). Почва опытных делянок серая лесная, супесчаная, рН 5.9-6.0, содержание гумуса 1.2-1.5%, учетная площадь делянки 2 м2. Полевой опыт был заложен на агробиологической станции Уманского
государственного педагогического университета им. Павла Тычины (Черкасская область). Почва опытных делянок темно-серая, оподзоленная, рН 5.4-5.7, содержание гумуса 1.6-2.0%, учетная площадь делянки 10 м2. Повторность опытов четырехкратная. Отбор растений для анализа производили в фазы 4 настоящего листа (36 сут от появления всходов), цветения (52 сут) и плодообразо-вания (66 сут).
Эффективность модуляторного действия лектина оценивали по вирулентности клубеньковых бактерий, азотфиксирующей активности клубеньков, нарастанию вегетативной массы растений и по их урожаю как интегральному показателю.
Интенсивность азотфиксации (нитрогеназную активность) определяли ацетиленовым методом [15] и выражали в мкмоль этилена, образованного клубеньками одного растения за 1 ч. Газовую смесь анализировали на хроматографе с пламенно-ионизационным детектором СЬгоша1^га£'-504 (Польша). Определения проводили в 5-кратной повторности.
Полученные результаты обрабатывали статистически [14], в таблицах представлены средние арифметические и их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Использование гомологичного лектина при изготовлении биопрепаратов приводило к повышению азотфиксирующей активности корневых клубеньков (табл. 1), что подтверждает ранее полученные нами данные об эффективности сим-биотической системы соя - B. japonicum при действии гомологичного лектина [11, 12]. Предварительная инкубация ризобий с лектином в концентрации 100 мкг/мл оказывала более выраженный стимулирующий эффект на интенсивность данного процесса по сравнению с концентрацией 300 мкг/мл в фазу цветения и плодообразова-ния. Азотфиксирующая активность клубеньков в фазу 4 настоящего листа была незначительно выше в вариантах с использованием лектина, однако эти значения были в пределах ошибки опыта. Например, в микрополевом опыте в фазу цветения, когда у сои уровень фиксации азота обычно достигает максимума, использование биопрепарата на твердом носителе с концентрацией лектина 300 мкг/мл не приводило к существенному изменению данного показателя, в то время как препарат, содержащий 100 мкг/мл, увеличивал азот-фиксацию на 17.2%. Аналогичная закономерность была отмечена и в полевом опыте. Усиление азофиксирующей активности клубеньков может быть связано с влиянием лектина растения-хозяина на синтез ферментов и продуктов азотного метаболизма. Исследование Мо-Бе-белка нитрогеназы позволило установить, что лек-
Таблица 1. Влияние биопрепаратов клубеньковых бактерий, модифицированных гомологичным лектином, на азотфиксирующую активность клубеньков сои, мкмоль С2Н4/(растение ч)
Носитель Концентрация лектина, мкг/мл Фаза развития
бактериальной суспензии 4 настоящих листа цветение образование бобов
Микрополевой опыт
Жидкий 0 15.66 ± 1.64 38.00 ± 1.45 9.98 ± 0.96
100 16.98 ± 1.49 42.19 ± 3.50 12.68 ± 0.59
300 16.58 ± 0.79 38.56 ± 3.74 10.14 ± 0.73
Твердый 0 17.42 ± 1.52 38.39 ± 0.80 9.96 ± 0.64
100 18.14 ± 1.24 45.00 ± 4.60 12.76 ± 0.30
300 18.00 ± 1.57 Полевой опыт 38.88 ± 0.52 10.38 ± 1.01
Жидкий 0 - 22.30 ± 1.56 8.72 ± 0.73
100 - 33.66 ± 3.54 10.56 ± 1.07
300 - 23.32 ± 2.60 9.17 ± 0.86
Твердый 0 - 28.09 ± 1.03 8.94 ± 0.41
100 - 40.28 ± 4.28 11.97 ± 1.15
300 - 27.34 ± 1.55 10.41 ± 1.06
Примечание:
- не определяли.
Таблица
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.