научная статья по теме ЭФФЕКТИВНЫЙ МЕТОД ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО α-ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА Химия

Текст научной статьи на тему «ЭФФЕКТИВНЫЙ МЕТОД ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО α-ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1996, том 22, № 3, с. 163-167

УДК 577.112.088.3

ЭФФЕКТИВНЫЙ МЕТОД ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО « ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА

© 1996 г. Р. В. Тихонов, С. Л. Якимов, В. Г. Коробко, А. Н. Вульфсон#

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 25.07.95 г.

Разработан эффективный и технологичный метод выделения из биомассы Е. coli и очистки реком-бинантного а-фактора некроза опухолей человека. Метод включает мембранную микрофильтрацию, две стадии ионообменной хроматографии с последующей гель-фильтрацией на сефадексе G-25 и позволяет получать высокоактивный рекомбинантный белок с чистотой >95% (по данным SDS-электрофореза и ВЭЖХ) с общим выходом около 50%.

Ключевые слова: рекомбинантный сс-фактор некроза опухолей человека, хроматография.

роксиапатите, относительно дорогом и неустойчивом сорбенте, с последующей доочисткой методом ВЭЖХ. При этом выход очищенного белка, по оценке авторов, составил около 12-15% [6].

В связи с вышеизложенным представлялось целесообразным применить для выделения а-ФНО относительно дешевые отечественные ионообменные сорбенты. В качестве источника фактора некроза опухолей использовали сконструированный в ИБХ РАН штамм Е. coli SG20050, содержащий рекомбинантную плазмиду pTNF31Д с искусственным геном, кодирующим мутантный а-ФНО без двух N-концевых аминокислотных остатков [7].

Биосинтез а-ФНО в клетках Е. coli SG20050, детерминированный плазмидой pTNF31A, приводил к накоплению рекомбинантного белка, растворенного в цитоплазме, что обусловило некоторые особенности его выделения (рис. 1,7). Для получения обогащенного раствора а-ФНО дезин-теграт после разрушения клеток ультразвуком подвергли микрофильтрации на мембранах с диаметром пор 0.2 мкм для отделения нерастворимого клеточного дебриса. Получили микрофильтрат, содержащий а-ФНО (рис. 1,2) и другие компоненты клеточной цитоплазмы. Обогащение микрофильтрата целевым белком обусловлено, по-видимому, удалением не прошедших через поры фильтра белков, связанных с клеточными мембранами.

Дальнейшая очистка а-ФНО проводилась с использованием ионообменной хроматографии. При этом необходима очистка микрофильтрата от примесей небелковой природы, загрязняющих и снижающих емкость ионообменной колонки.

a-Фактор некроза опухолей (а-ФНО) - белок с молекулярной массой ~17 кДа, продуцируемый моноцитами и макрофагами в ответ на их активацию липополисахаридом при бактериальной инфекции [1] (биологически активен в виде тримера массой 51 кДа). Большой интерес к этому цитоки-ну определяется его цитотоксической активностью in vitro по отношению к опухолевым клеточным линиям, а также способностью вызывать геморрагический некроз некоторых опухолей in vivo. Хотя биологическая роль а-ФНО все еще не выяснена полностью, этот белок, несомненно, играет важную роль в формировании иммунного ответа организма. Следует отметить, что широкое клиническое изучение а-ФНО сдерживается из-за его высокой токсичности для организма в концентрациях выше 500 ед. акт. на 1 мл крови [2]. Один из подходов к преодолению этой проблемы заключается в получении методами белковой инженерии мутантных форм а-ФНО, обладающих меньшей токсичностью для организма, создании штаммов-продуцентов Е. coli таких мутантов и разработке методов выделения мутантных белков в количествах, необходимых для изучения их биологических свойств.

В настоящее время для выделения а-ФНО из бактериальной массы используется многостадийная схема очистки, включающая адсорбционную, ионообменную и эксклюзионную хроматографию [3-5]. При этом суммарный выход белка не превышает 20%. Недавно была опубликована работа [6], в которой описан простой метод выделения а-ФНО с использованием хроматографии на гид-

# Автор для переписки.

Рис. 1. Гель-электрофореграмма образцов а-ФНО на различных стадиях выделения (в скобках - содержание а-ФНО, %): I - биомасса клеток Е. coli (24); 2 - микрофильтрат дезинт.е грата а-ФНО (30); 3 - объединенная фракция а-ФНО после аиионообменной хроматографии (65); 4 - объединенная фракция а-ФНО после катионообменной хроматографии (98); 5 - белки-маркеры.

Для этой цели был использован инертный носитель Н-у-гель, удерживающий эти примеси и не сорбирующий белок.

Очищенный таким образом микрофильтрат хроматографировали на колонке с С>АЕ-у-гелем.

180 мин

200 240 мин

Рис. 2. Хроматографическое выделение а-ФНО на ОАЕ-у-геле (а,, отмечена выделяемая фракция) с последующей хроматографией на Р-у-геле (б). Условия см. "Экспер. часть".

а-ФНО элюировался с колонки при концентрации NaCl от 0.12 до 0.2 М (рис. 2а). Чистоту препарата оценивали с помощью SDS-электрофореза (рис. 1,..?). Чистота фракции а-ФНО составила 65%.

Заключительную стадию очистки а-ФНО провели с использованием катионообменной хроматографии на колонке с Р-у-гелем. а-ФНО элюировался с колонки при концентрации NaCl от 0.25 до 0.3 М (рис. 26). Чистота препарата, по данным SDS-электрофореза (рис. 1, 4) и ВЭЖХ (рис. За), составила > 98%.

Полученный препарат переводили в буферный раствор Б (см. "Экспер. часть"), стерильно фильтровали и хранили в том же буферном растворе при 4°С. Через 2 месяца при указанных условиях хранения изменений биологической активности а-ФНО не наблюдалось.

Результаты очистки а-ФНО приведены в таблице. Предлагаемый метод выделения позволил получить а-ФНО высокой чистоты с выходом 47-56%. По данным SDS-электрофореза, молекулярная масса а-ФНО составляет 17 кДа (вычисленное значение - 16921.58 Да). Полученный белок а-ФНО охарактеризован спектрально. Спектр КД (рис. 36) полностью совпал со спектром, известным из литературы [8]. Результаты 12 шагов N-концевого анализа а-ФНО согласуются с известной аминокислотной последовательностью этого белка [3];

3 10

Ser -Ser-Ser- Arg-Thr-Pro-Ser- Asp -Lys-Pro-Val-Ala-.

Биологическая активность, определенная в ци-тотоксическом тесте на линии клеток WEHI, составила 2 х 107 ед./мг.

ЭФФЕКТИВНЫЙ МЕТОД ОЧИСТКИ [8], град см2 дмоль~'

190 200 210 220 230 240 250 нм

Рис. 3. Характеристики конечного продукта а-ФНО. (а) - аналитическая ВЭЖХ (50 мкг) на колонке Армсорб-Си-500-ОЕАЕ. Условия см. "Экспер. часть"; (б) - спектр КД а-ФПО (0.9 мг/мл, 50 мМ трис-НС1, рН 7.5).

Таким образом, разработанный нами метод выделения и очистки рекомбинантного а-ФНО из биомассы Е. соИ позволяет получать в препаративных количествах высокоочищенный, биологически активный препарат в течение короткого времени с использованием двух хроматографи-ческих стадий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использованы: ацетат натрия (ос. ч.), ацетонитрил (ос. ч., для жидкостной хроматографии), гидроксид натрия (ч. д. а.), лимонная кислота (ос. ч.), соляная кислота (ч. д. а.), хлорид натрия (ч. д. а.) отечественного производства; додецил-сульфат натрия (Serva, Германия), трис(гидрокси-

метил)аминометан (Gerbu, Германия), EDTA (Chemtam, Швеция), акриламид, 1Ч,Г\Г-метиленбис-акриламид, персульфат аммония, TEMED, кумас-си R-250 (Sigma, США); набор белков-стандартов для электрофореза и гель-фильтрации (Pharmacia, Швеция); вода, очищенная на установке Milíi Q (Millipore, США); отечественные хроматографи-ческие сорбенты (ВНИИОЧБ, Санкт-Петербург; совместные разработки с ИБХ РАН) Р-у-гель, QAE-y-гель, Н-у-гель; сефадекс G-25 Superfine (Pharmacia, Швеция).

Биомасса штамма Е. coli SG20050 pTNF31A выращена в группе ферментации лаборатории биотехнологии с комплексной опытной установкой (КОУ) ИБХ РАН.

Выделение и очистка а-ФНО

Стадия Суммарный белок, мг а-ФНО Очистка, раз Выход, % от исходного а-ФНО

по данным SDS-электрофореза, % мг

Дезинтеграция биомассы 1125 24 270 1.00 100

Микрофильтрация дезинтеграта 875 30 262 1,25 97

Очистка на Н-у-геле и хроматография на ОАЕ-у-геле 340 65 221 2.17 _ 82

Хроматография на Р-у-геле 143 >98 140 1.51 52

Гель-фильтрация 130 >98 127 1.00 47

Использовали буферные растворы: 50 мм трис-НС1 (рН 7.5), 2 мМ EDTA (А); 50 мМ трис-НС1, рН 7.5 (Б); 30 мМ лимонная кислота, рН 5.0 (В); 0.1 М гидроксид натрия, 1 М хлорид натрия (Г).

Выделение а-ФНО. Отделенные центрифугированием из 1 л культуральной жидкости и промытые буферным раствором А клетки биомассы Е. coli (14 г) с содержанием а-ФНО 24% от суммарного клеточного белка (по данным SDS-элек-трофореза) суспендировали в 100 мл буферного раствора А, помещали в лед и разрушали клетки с помощью ультразвукового дезинтегратора Son-ifier 250 (Branson, США) при амплитуде 60% шкалы прибора. Обработку клеток ультразвуком проводили 4 раза по 5 мин с перерывами по 2 мин так, чтобы температура взвеси не превышала 50°С. Дезинтеграт подвергали микрофильтрации на установке Minitan (Millipore, США) на кассетах GVLP с диаметром пор мембран 0.2 мкм со скоростью 10 мл/мин. Для более полного извлечения белка суспензию промывали буферным раствором А в количестве 4-5 внутренних объемов микрофильтрационной установки. Мембраны регенерировали 0.1% раствором додецилсульфата натрия в течение 30 мин.

Микрофильтрат разбавляли дистиллированной водой так, чтобы удельная электропроводность раствора составляла 2.0 ± 0,1 мкСм/см, и пропускали через колонку (2.5 х 10 см) с Н-у-ге-лем, последовательно соединенную с колонкой (2.5 х 15 см) с QAE-y-гелем. Обе колонки перед использованием промывали буферным раствором Г по 150 и 200 мл соответственно и уравновешивали буферным раствором Б (5 мл/мин). Колонки промывали 100 мл буферного раствора Б, затем колонку с Н-у-гелем отключали и элюиро-вали а-ФНО с колонки с QAE-y-гелем в линейном градиенте концентрации NaCl (0-0.4 М) в буферном растворе Б (общий объем 500 мл). Фракции, содержащие а-ФНО чистотой не менее 65% по данным SDS-электрофореза, объединяли, разбавляли дистиллированной водой в 2 раза; рН объединенной фракции доводили до 5.0 с помощью 1 М НС1. После этого ее наносили на колонку (1.5 х 15 см) с Р-у-гелем, промытую 120 мл буферного раствора Г и уравновешенную буферным раствором В (2 мл/мин). Элюцию проводили в линейном градиенте концентрации NaCl (0-0.4 М) в буферном растворе В (общий объем 400 мл). Собирали фракции,

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком