ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2012, том 38, № 5, с. 97-101
УДК 612.018:612.112.94
ЭФФЕКТЫ ДЕГИДРОЭПИАНДРОСТЕРОНА СУЛЬФАТА НА ИНДУЦИРОВАННЫЙ АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ
ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ © 2012 г. Е. В. Жернова, С. А. Иванова
ФГБУНаучно-исследовательский институт психического здоровья Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Томск Поступила в редакцию 25.07.2011 г.
Проведено изучение влияния дегидроэпиандростерона сульфата на морфологические изменения и уровень белков апоптоза (Вс1-2 и ca.spa.se-3) в лимфоцитах 6 здоровых лиц в условиях индуцированного окислительного стресса и под влиянием этанола. Выявлено токсическое действие гидроперок-сида на процессы апоптоза клеток, в то время как добавление в культуральную среду этанола не приводило к значимым изменениям исследуемых параметров. Дегидроэпиандростерон сульфат оказывал выраженный антиапоптотический эффект на лимфоциты периферической крови здоровых людей, защищая их от пагубного воздействия активных форм кислорода.
Ключевые слова: дегидроэпиандростерон сульфат, индуцированный апоптоз, лимфоцит.
Апоптоз — форма запрограммированной клеточной гибели — является необходимым компонентом жизнедеятельности организма, осуществляется и контролируется генетическими, иммунными, гормональными механизмами. Феномен апоптоза является результатом действия различных факторов, приводящих к гибели клетки; физиологическими регуляторами апоптоза являются некоторые гормоны [1]. Особый интерес представляет собой изучение гипоталамо-гипо-физарно-надпочечниковой системы, основной функцией которой является адаптация организма в меняющихся условиях внешней среды [2]. Стероиды, в частности дегидроэпиандростерон сульфат (ДГЭАС), являются важными регуляторами в функционировании центральной нервной системы и могут быть вовлечены в процессы клеточной гибели [3, 4]. Так в работе [4] были продемонстрированы защитные свойства ДГЭАС на повреждения клеток нейробластомы линии ЗИ-БУ5 У, вызванные пероксидом водорода в отношении активной каспазы-3 и митохондриального мембранного потенциала. Также существуют исследования, показывающие протективные эффекты ДГЭАС на гипоталомические нейрональ-ные повреждения, вызванные возбудимыми аминокислотами и кортикостероном [5]. Авторы работы [3] продемонстрировали позитивное влияние ДГЭАС на процессы запрограммированной клеточной гибели симпатоадреналовых медуллярных клеток. С другой стороны, ДГЭАС вовлечен в патофизиологические процессы при алкоголизме [6].
В литературе показано, что длительный прием алкоголя приводит к изменениям в активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси [7]. Злоупотребление алкоголем сопровождается значительной перестройкой нейромедиаторных, нейроэндокринных, биохимических и иммунологических процессов организма, что приводит к нарушению взаимодействия нервной и иммунной систем, срыву нейрогуморальных компенсаторных механизмов [8, 9]. Этанол может вызывать окислительную деструкцию мембран, повреждать ДНК, влиять на функцию белков, но еще более реакционно-способными являются его метаболиты. В процессе метаболизма этанола в организме образуются активные формы кислорода, оказывающие повреждающее воздействие на клетку [10]. Показана роль апоптоза в патогенезе алкоголь-индуцированного поражения органов [9, 11-13].
Исходя из этих данных, представляет интерес изучение гипотетической возможности применения дегидроэпиандростерона сульфата для защиты лимфоцитов от воздействия индукторов апоптоза, в частности, окислительного стресса и этанола.
Для оценки влияния стероида на процессы запрограммированной клеточной гибели важным представляется исследование концентрации про-и антиапоптотических белков, поскольку именно относительный уровень протеаз определяет судьбу клетки — апоптоз или жизнь. Белок Вс1-2 (антиапоптотический) — один из основных регуляторов апоптоза, в случае избыточного присутствия
нг/мл 14
12
10
8
6
4
2
Ж».
ж», лт
Ж». Ж». Ж»»
mv»1
Интактные 140 мкМ ГПТБ 0.5% этанол клетки
Рис. 1. Уровень Вс/-2 в лимфоцитах при инкубации с гидроперекисью третичного бутила (ГПТБ) и 0.5% этанолом.
* р < 0.05 по сравнению с контролем.
данного белка в клетке формируются факторы, ингибирующие апоптоз [14]. Активация каспаз является ключевым моментом в промежуточных и терминальных стадиях апоптоза [15].
Целью настоящей работы явилось изучение влияния дегидроэпиандростерона сульфата на морфологические изменения и уровень белков апоптоза лимфоцитов здоровых доноров в условиях индуцированного окислительного стресса и под влиянием этанола in vitro.
МЕТОДИКА
В качестве экспериментального материала использованы лимфоциты периферической крови 6 психически и соматически здоровых лиц.
Отбор здоровых лиц проводили, используя углубленный опрос с помощью специальной анкеты, разработанной в лаборатории клеточных и мол екулярно - биологических исследований НИИПЗ СО РАМН. Вопросы, приведенные в анкете, позволяют при формировании группы контроля исключить лица с возможными нарушениями соматического или психического здоровья. Исследование проводилось в строгом соответствии с биоэтическими нормами. Протокол исследования, информация для лиц, участвующих в исследовании, и форма информированного согласия были одобрены локальным этическим комитетом.
Забор венозной крови у здоровых доноров проводили утром, натощак. Лимфоциты выделяли из гепаринизированной крови общепринятым методом [16] на градиенте плотности Ficoll-Paque ("Pharmacia", Швеция). Далее клетки культивировали с тремя тестируемыми веществами: раствором Хенкса (контроль), 140 мкМ гидроперекиси третичного бутила (моделируя ситуацию
окислительного стресса) и 0.5% этанолом. Указанные концентрации исследуемых веществ были подобраны исходя из литературных данных [17— 19]. Для изучения эффекта ДГЭАС лимфоциты предварительно инкубировали с 20 мкл стероида в концентрации 10 мкг/мл в течение 18 часов, а затем добавляли исследуемые индукторы.
Концентрацию белков апоптоза Bcl-2 (анти-апоптотического) и caspase-3 (проапоптотическо-го) определяли в лизате клеток методом иммуно-ферментного анализа с использованием наборов human Caspase-3 instant ELISA и human Bcl-2 ELISA (Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria). Морфологические изменения лимфоцитов, характерные для апоптоза, оценивали методом световой микроскопии мазков крови. Мазки фиксировали 5 мин в азур-эозине метиленовом синем по Май-Грюнвальду и окрашивали 40 мин по Романовскому-Гимза [20].
Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакета STATISTICA, версия 6.0 для Windows. Производили расчеты средней арифметической (М), среднеквадратиче-ского отклонения (а), ошибки средней арифметической (m). Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрического критерия Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни. Различия оценивали как достоверные при P < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Количество Вс/-2 в контрольных культурах лимфоцитов в нашем эксперименте составило 11.5 ± 0.9 нг/мл. В культурах, подвергшихся действию окислительного стресса, индуцированного 4-часовой инкубацией с гидропероксидом третичного бутила, наблюдалось достоверное снижение уровня антиапоптотического белка (5.5 ± ± 0.8 нг/мл). Выявленные эффекты хорошо согласуются с данными других авторов о нарушениях процессов апоптоза различных типов клеток в условиях окислительного стресса [21—23]. Так авторы работы [24] доказали, что при действии оксида азота на клетку значительно понижается уровень внутриклеточного Вс/-2 белка. В работе Лямзаева К.Г. [25] показано, что пероксид водорода вызывал гибель 20—30% клеток ИеЬа через 17 часов после добавления. Добавление в культу-ральную среду 0.5% этанола не приводило к статистически значимым изменениям содержания Вс/-2 в лимфоцитах (рис. 1).
Предварительное культивирование клеток с ДГЭАС приводило к нормализации количества антиапоптотического белка в лимфоцитах, подвергшихся окислительному стрессу. Так, количество Вс/-2 увеличивалось в 1.5 раза под действием стероида (рис. 2).
*
0
Полученные нами экспериментальные данные доказывают выраженное антиапоптотическое действие исследуемого гормона на лимфоциты в отношении белка Вс1-2, защищая их от пагубного воздействия активных форм кислорода.
Количество сазразе-3 в интактных клетках составило 3.8 ± 0.09 мкг/мл. В клетках, подвергшихся действию гидроперекиси третичного бутила, наблюдалось увеличение уровня проапоптотиче-ского белка (6.3 ± 0.16 мкг/мл). Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях окислительного стресса наблюдается индукция апо-птоза лимфоцитов, что выражается в значительном увеличении уровня проапоптотического белка сазразг-Ъ. Инкубация с этанолом не вызывает значимого увеличения концентрации сазразг-Ъ в клеточной культуре (3.9 ± 0.09 мкг/мл, в контроле — 3.8 ± 0.09 мкг/мл).
Долгосрочная прединкубация с дегидроэпиан-дростероном сульфатом приводила к снижению количества исследуемого белка в лимфоцитах по сравнению с инкубацией без добавления протектора. Выявлены защитные свойства препарата по отношению к экспериментальному окислительному стрессу: концентрация проапоптотического белка сазразе-3 снижалась в 3.7 раза под действием ДГЭАС (табл. 1). В клетках, подвергшихся действию 0.5% этанола, наблюдалось статистически значимое снижение количества белка по сравнению с инкубацией интактных клеток в тех же условиях без стероида.
При исследовании апоптоза важно сочетать несколько методов, основанных на различных принципах выявления. Наиболее информативной, по мнению многих исследователей, остается оценка структурных изменений клеток с помощью светового микроскопа [20]. Поэтому, наряду с исследованием уровня белков апоптоза, нами проведен цитологический анализ апоптотиче-ских форм лимфоцитов. В клетках, инкубированных 18 часов без добавления индукторов, уровень лимфоцитов с фрагментированным ядром составил 6.81 ± 0.66%, что соответствует литературным данным. В работе [26] показано, что после 20-часового культивирования лимфоцитов здоровых доноров в полной питательной среде количество
нг/мл
14 -
12 -
10 -
8 -
6 -
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.