РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2010, том 50, № 6, с. 632-641
МАТЕРИАЛЫ МЕЖДУНАРОДНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ "БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ И РАДИОАКТИВНОЕ ЗАГРЯЗНЕНИЕ СРЕДЫ (БИОРАД-2009)" (СЫКТЫВКАР, 28 СЕНТЯБРЯ-1 ОКТЯБРЯ 2009 г.)
УДК 574::539.1.04:582.4
ЭФФЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (Pinus sylvestris L.) В ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ ЗОНЕ ОТЧУЖДЕНИЯ
© 2010 г. В. И. Йощенко*, В. А. Кашпаров,С. Е. Левчук, Ю. О. Бондарь,
Н. М. Лазарев, М. И. Йощенко
Украинский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии Национального университета биоресурсов и природопользования Украины (УкрНИИСХР НУБиП Украины), Киев, Украина
Получены количественные зависимости "мощность дозы—эффект" для цитогенетических повреждений в проростках семян и в апикальной меристеме сосны обыкновенной в насаждениях Чернобыльской зоны. Рассмотрены особенности динамики формирования морфологических эффектов для исследованного вида в условиях внутреннего и внешнего хронического облучения. Установлена корреляция между эффектами облучения на морфологическом и клеточном уровнях. Предложен механизм формирования морфологических изменений.
Pinus sylvestris L., Чернобыльская зона отчуждения, радиоактивное загрязнение, хроническое облучение, морфологические эффекты, цитогенетические эффекты, зависимость "доза-эффект".
В настоящей статье представлены результаты цикла исследований УкрНИИСХР НУБиП Украины эффектов хронического облучения искусственных насаждений сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в Чернобыльской зоне отчуждения. В нашей предыдущей публикации [1] сформулированы предпосылки и задачи данных исследований, приведена их общая структура и характеристики экспериментальных площадок, детально рассмотрена дозиметрия выбранного объекта исследований, установлена количественная зависимость "мощность дозы — частота морфологических изменений" в обследованном массиве деревьев. Поскольку в настоящей публикации идет речь об исследованиях в тех же популяциях, мы считаем возможным не приводить здесь их описание и опустить ряд изложенных в [1] общих методических моментов.
Настоящая статья посвящена эффектам хронического внутреннего и внешнего облучения в клетках меристемы сосны. Рассмотрена динамика формирования морфозов у деревьев массива, поскольку эта информация может быть полезной для понимания механизмов радиобиологических эффектов у изучаемого вида. Интерпретация полученных зависимостей основана на установленной в исследовании корреляции между эффекта-
* Адресат для корреспонденции: Украина, 08162 Киевская обл., Киево-Святошинский р-н, Чабаны, ул.Машиностро-ителей, 7, УкрНИИСХР; тел.: (380 44) 526-24-44; факс:(380 44) 526-07-90; e-mail: vasyl@uiar.kiev.ua.
ми на разных уровнях биологической организации. Принимая во внимание широкий диапазон дозовых нагрузок на деревья массива (от нескольких мГр/год до нескольких Гр/год на верхушечную меристему), логично будет предположить, что в разных частях этого диапазона наблюдаемый эффект обусловлен преимущественным действием разных механизмов, что указывает на необходимость проведения дальнейших исследований в данной области.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Цитогенетические исследования
Исследование радиационно-индуцированных повреждений в клетках меристемы проростков семян проводилось методом прямого подсчета аберраций, а в клетках апикальной меристемы (ткани почек) — методом гелевого электрофореза отдельных клеток (Comet assay). Попытка применить первый метод и для клеток апикальной меристемы не принесла достоверных результатов из-за низкой митотической активности.
Для проведения исследований было выбрано несколько модельных деревьев экспериментального массива со средними параметрами развития из разных дозовых групп таким образом, чтобы они равномерно представляли весь диапазон мощностей доз [1]. Для анализа методом Comet каждая дозовая группа была по возможности представлена двумя деревьями — одним с морфо-
зом и одним без морфоза. Пробы почек этих деревьев отбирались в весенне-летний период 2009 г.
Частота аберраций. В ноябре 2006 и 2007 годов с модельных деревьев были отобраны все шишки, находящиеся на соответствующей стадии развития, и выдержаны в воздушно-сухих условиях до наступления периода так называемой "весенней засухи", т.е. до их раскрытия и вылета семян. Собирались все семена с каждого дерева. Исследования проводились по методике, использованной в Чернобыльской зоне лабораторией С.А. Герась-кина [2]. В лабораторных условиях семена проращивались при температуре 22°С в чашках Петри на подстилке из влажного ватного тампона и фильтровальной бумаги при оптимальном балансе влаги. В чашке Петри одновременно проращивали не более 30 семян, при этом расстояние между отдельными семенами составляло около 1 см.
Фиксацию проростков проводили уксусным алкоголем [3] или фиксатором Кларка (3 : 1). Фиксатором заполняли 2/3 стеклянной емкости с плотно закрытой крышкой с не более чем 20 проростками. Первые митозы наблюдались при длине корешков 7—9 мм, при длине 5 мм митозов еще не было, а при длине 10 мм в меристеме оставалось только 5—10 делящихся клеток. В период первой волны митозов количество анафазных и телофазных клеток в одном корешке достигало 120.
Для дальнейших исследований препарат окрашивали ацетокармином. На предметное стекло в каплю ацетокармина помещали кончик корешка размером 1.5—2.0 мм, препарат накрывали покровным стеклом и осторожно дробили до отделения большей части препарата от основы корешка. После нагревания над спиртовой горелкой в течение нескольких секунд препарат был готов для анализа под микроскопом.
Анализировались только неповрежденные хорошо различимые под микроскопом клетки. В пределах поля зрения подсчитывали общее количество клеток, профаз, метафаз, анафаз, телофаз и интерфаз для определения митотического индекса. Было проанализировано 9900—10700 клеток апикальной меристемы проростков для каждого дерева, с которого отбирались шишки. В анафазных и телофазных клетках подсчитывали число аберраций каждого вида. В качестве основных количественных показателей эффекта облучения рассматривали процент аберрантных анафаз, телофаз и анателофаз. Исследования проводились с помощью микроскопа "Axioskop 40" (Carl Zeiss), оснащенного фотокамерой для сохранения изображений на компьютере в цифровом формате.
Метод гелевого электрофореза отдельных клеток. Существуют различные варианты метода ге-левого электрофореза отдельных клеток (Comet
Assay) [4—13]. В нашей работе использована одна из его модификаций, применяемая для проведения анализов растительных проб [5]. Для подготовки слайдов предметные стекла несколько раз погружали в 1%-ный раствор агарозы нормальной температуры плавления (TopVision Agarose LE #R0491, Fermentas) в дистиллированной воде (50°С) и высушивали при комнатной температуре. Все последующие процедуры проводили в затемненном помещении во избежание повреждений ДНК. В чашку Петри вливали 400 мкл холодного модифицированного Соренсенового буфера (50 ммоль/л фосфат натрия рН 6.8, 0.1 ммоль/л EDTA, 0.5%-ный диметилсульфоксид DMSO). Чистым лезвием бритвы пробу аккуратно нарезали тонкими слоями и несколько раз обмакивали в буфер. Чашку Петри выдерживали на льду в наклонном положении, чтобы вымытые с пробы ядра собирались в буфере. С чашки отбирали 45 мкл суспензии ядер и переносили в микропробирку, находящуюся в термостате при 37°С. В нее добавляли такой же объем 1%-ного раствора агарозы низкой температуры плавления (TopVision Agarose LM #R0801, Fermentas) в фосфатно-буфер-ном физиологическом растворе при 37°С, и смесь аккуратно перемешивали. Полученную суспензию ядер в 0.5%-ном растворе агарозы микродозатором переносили на подготовленный слайд, накрывали покровным стеклом и выдерживали не менее 5 мин на ледяной поверхности, после чего покровное стекло снимали и на слайд наносили 90 мкл 0.5%-ного раствора агарозы низкой температуры плавления. Слайд опять накрывали покровным стеклом, выдерживали на льду минимум 5 мин, снимали стекло и помещали слайд в горизонтальный танк для электрофореза, наполненный свежеприготовленным буфером для холодного электрофореза (1 ммоль/л Na2EDTA и 300 ммоль/л NaOH, pH > 13) таким образом, чтобы уровень буфера был на 2—3 мм выше поверхности слайда. В таком состоянии слайды выдерживались в танке в течение 30 мин при 4°С для "расплетения" нитей ДНК и высвобождения мест повреждений.
Отметим, что в данной (щелочной) реализации метода освобождаются не только одно- и дву-нитевые разрывы ДНК, но и щелочно-лабильные сайты ДНК, поэтому часть фрагментов ДНК образуется в результате повреждения хромосом агрессивным буфером, что увеличивает общее количество повреждений. С другой стороны, нейтральный Comet assay, согласно литературным данным, чувствителен только при дозах выше 5 Гр.
Электрофорез осуществляли в течение 30 мин при температуре 4°С, напряжении 32 В и силе тока 200 мА. По окончании слайды трижды ополаскивали 400 ммоль/л Tris, рН 7.5, подсушивали и окрашивали каждый 70 мкл бромида этидия
Рис. 1. Типичный вид "кометы" для проб апикальной
меристемы деревьев экспериментального массива
(площадка Иванков, увеличение объектива х20).
(20 мкг/мл, MO Bio Laboratories Inc) на протяжении 5 мин, после чего остатки флуоресцентного красителя смывали ледяной водой, слайды накрывали покровными стеклами и анализировали в режиме флуоресценции с использованием соответствующего фильтра на микроскопе Axioskop 40.
Для каждой пробы было получено до сотен четких изображений "комет" (рис. 1). Для каждой "кометы" определяли ряд показателей, количественно характеризующих степень повреждения ядра. Эти показатели в дальнейшем использовали для построения зависимости "доза—эффект":
Head DNA — процент материала ДНК, оставшийся в ядре после электрофореза;
TailDNA — процент материала ДНК, мигрировавший из ядра;
TailMoment, TM — произведение TailDNA на длину хвоста "кометы" в пикселах;
OliveTailMoment, OTM — произведение TailDNA на расстояние в пикселах между центрами масс ядра и хвоста.
Первые два показателя определяли по суммарной свети
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.