НЕЙРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 4, с. 299-303
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.171.6:576.367:612.82:612.65
ЭФФЕКТЫ КЛОНИДИНА И ИОХИМБИНА НА УРОВНИ МРНК Бах,
Bei-XL и каспазы-э в головном мозге неонатальных крыс
© 2008 г. Ф. А. Ильиных*, Т. С. Калинина, Н. Н. Дыгало
Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск
Введение 3-дневным детенышам крыс стимулятора альфа2-адренорецепторов клонидина (0.4 мг/кг) снижало через 120 ч после воздействия количество мРНК проапоптозного белка Bax в гиппокампе и повышало содержание мРНК антиапоптозного белка Bcl-XL в стволе головного мозга. Блокатор альфа2-адренорецепторов иохимбин (2 мг/кг) в этот же срок после воздействия повышал уровень мРНК Bcl-XL в гиппокампе. Наряду с этими изменениями, специфичными для каждого из препаратов, они оба понижали через 24 ч количество мРНК Вах в коре и через 120 ч основной исполнительной протеазы апоптоза каспазы-3 в гиппокампе. Однонаправленное с клонидином действие иохимбина свидетельствует о возможном вовлечении в эффекты блокатора альфа2-адрено-рецепторов эндогенного норадреналина, выброс которого он индуцирует. Результаты работы дают возможный механизм, который способен обеспечить опубликованные свидетельства нейропротек-торного действия как агонистов, так и антагонистов альфа2-адренорецепторов.
Ключевые слова: альфа2-адренорецепторы, апоптоз, головной мозг, постнаталъное развитие, мРНК.
Программируемая гибель клеток, или апоптоз, является неотъемлемым компонентом нормального развития нервной системы млекопитающих [1-3]. В процессе естественного формирования мозга до половины изначально заложенных нервных клеток элиминируются. Основными регуляторами апоптоза являются белки семейства Вс1-2 - антиапоптозный белок Вс1-Хь и проапоптозный белок Вах [4-6]. Антиа-поптозные члены семейства блокируют действие проапоптозных белков. Конечным эффектором апоптоза в клетках нервной системы является ци-стеиновая протеаза каспаза-3 [7-9], после активации которой процесс гибели клетки становится необратимым [10, 11].
Одним из наименее изученных аспектов апоптоза является влияние внеклеточных сигналов на предрасположенность клетки к запуску программируемой гибели. Мембранные альфа2-ад-ренорецепторы (альфа2-АР) являются ключевыми регуляторами функции норадренергических нейронов, так как определяют количество высвобождаемого медиатора. Эффекты лигандов аль-фа2-АР на жизнеспособность клеток нервной системы млекопитающих неоднозначны и противоречивы. При нарушении структуры мозга под действием ишемии нейропротекторное действие проявляют как агонисты [12, 13], так и антагони-
* Адресат для корреспонденции: 630090, Новосибирск, просп. Лаврентьева, д. 10; тел.: 333-27-13; e-mail: ifa83@bionet.nsc.ru
сты [14, 15] альфа2-АР. Кроме того, неясно, какие из этих эффектов адренергических препаратов сопряжены с их действием на механизм апоптоза. Ранее было показано, что высокие дозы стимулятора альфа2-АР клонидина повышают экспрессию гена каспазы-3 и количество фраг-ментированной ДНК, являющейся классическим признаком апоптоза, в стволе головного мозга
21-дневных эмбрионов крыс и 8-дневных животных [11]. Вместе с тем, вопрос об эффектах и продолжительности действия терапевтических доз адренергических препаратов, использующихся в клинической перинатологической практике [16], остается открытым. Целью исследования явилось изучение действия альфа2-адренолигандов на уровни мРНК белков апоптоза в формирующемся головном мозге крыс.
МЕТОДИКА
Животные. В работе использовали крыс линии Вистар, содержавшихся в стандартных условиях вивария иЦиГ СО РАН: при температуре
22-24°С, естественном освещении и свободном доступе к воде и корму. Для получения самок с датированным сроком беременности ссаживали 3 самки и самца. Первым днем беременности считался день обнаружения спермы во влагалищном мазке, первым днем жизни - день родов. Число детенышей крыс в каждом помете выравнивалось до 8 особей.
Экспериментальные воздействия. В качестве агониста и антагониста альфа2-АР использовали
w ч
о &
н м о м н
о
#
100
75
я 50 «
Д
Рч
S
25
24
120 Часы
Рис. 1. Изменение уровня мРНК проапоптозного белка Бах в коре головного мозга после введения клони-дина или иохимбина. По оси абсцисс - время после введения, по оси ординат - уровень мРНК в процентах по отношению к уровню контрольных животных, принятому за 100% (пунктирная линия). 1 - клонидин, 2 - иохимбин. Координаты точек по оси ординат соответствуют средней арифметической, вертикальные линии - ошибке среднего (для рис. 1-5). * р < 0.05 по сравнению с контролем (LSD критерий Фишера).
фармакологические препараты клонидина гидрохлорид и иохимбина гидрохлорид (Sigma, США).
Клонидин (0.4 мг/кг) или иохимбин (2 мг/кг) вводили подкожно 3-дневным детенышам крыс в 20 мкл физиологического раствора (0.9% NaCl). Контрольным животным вводили только эквивалентное количество физиологического раствора. В каждом помете присутствовали детеныши как минимум из двух экспериментальных групп. На 4-е или 8-е сутки жизни, т.е. соответственно через 24 или 120 ч после воздействия, детенышей крыс забивали быстрой декапитацией. Всего было сформировано 3 экспериментальные группы. Каждая группа состояла из 4-8 животных. У детенышей выделяли гиппокамп, ствол, включающий задний мозг и область моста - весь блок ткани каудаль-нее задних бугров четверохолмия и ростральнее овального отверстия без мозжечка, а также фронтальную кору, которая включала фронтальную половину верхней поверхности полушарий толщиной 1.5-3 мм.
Полуколичественное определение уровня мРНК. Уровни мРНК генов каспазы-3, bcl-XL и bax определяли полуколичественной ревертив-ной ПЦР в суммарной РНК, выделенной одностадийным гуанидин-изотиоцианатным методом [17]. Для получения кДНК использовали Oligo-dT-праймер и обратную транскриптазу MuLV (СибЭнзим, Россия). Амплификацию специфичных для каждого гена участков кДНК проводили по стандартной методике [18] с использованием праймеров для каспазы-3 [19], bax [20], bcl-XL [21]
или бета-актина [22]. Для каждой пары праймеров количество циклов амплификации при выбранном температурно-временном режиме соответствовало экспоненциальной фазе нарастания оптически выявляемого продукта ПЦР. Уровень мРНК каспазы-3, Bax и Bcl-XL оценивали относительно мРНК бета-актина после сканирования в ультрафиолетовом свете продуктов ПЦР (BioDoc II Video Detection System, Biometra GmbH, Германия), разделенных электрофорезом в 1.5%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этиди-ем, и последующей компьютерной денситомет-рии (Scion Image, США).
Статистика. Полученные данные представлены в виде среднего ± ошибка среднего. Математическую обработку проводили с использованием пакета статистических программ Statistical влияние адренолигандов на уровни экспрессии исследуемых генов в отделах мозга 4- и 8-суточных детенышей крыс оценивали двухфакторным дисперсионным анализом (ANOVA), достоверность различий между группами животных устанавливали согласно LSD-критерию Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Через 24 ч после введения препаратов достоверные изменения наблюдались лишь в уровне мРНК Вах в коре головного мозга (рис. 1). В этом отделе мозга и стимулятор альфа2-АР клонидин, и блокатор этих рецепторов иохимбин временно снижали количество транскрипта проапоптозного белка Bаx в коре головного мозга детенышей крыс (влияние препаратов F(2, 36) = 3.21; р < 0.05; рис. 1) с восстановлением исходного уровня экспрессии уже через 120 ч после введения препаратов. В гиппокампе и стволе мозга изменение количества транскриптов исследуемых генов наблюдалось только через 5 сут после введения адренолигандов.
Введение блокатора альфа2-АР иохимбина избирательно повышало концентрацию транскрипта антиапоптозного белка Bcl-XL в гиппокампе 8-суточных крысят по сравнению с введением клонидина и контрольными животными (F(2, 33) = = 5.76; р < 0.01; рис. 2). Стимуляция адренорецеп-торов клонидином, напротив, приводила к избирательному снижению уровня мРНК проапоптозного белка Bаx в этой структуре мозга по сравнению с введением иохимбина и контрольными детенышами крыс (влияние препаратов F(2 33) = = 7.03; р < 0.01; рис. 3).
Действие обоих адренолигандов в гиппокампе привело к однонаправленному снижению уровня мРНК конечного эффектора апоптоза в клетках нервной ткани - каспазы-3. Введение как клонидина, так и иохимбина снизило уровень мРНК этой исполнительной протеазы апоптоза в гиппо-
0
Часы
Рис. 2. Изменение уровня мРНК антиапоптозного белка Bcl-XL в гиппокампе после введения клонидина или иохимбина. 1 - клонидин, 2 - иохимбин. Остальные обозначения см. на рис. 1. * р < 0.001 по сравнению с контролем и введением клонидина (LSD критерий Фишера).
50 —1-1-
0 24 120
Часы
Рис. 3. Изменение уровня мРНК проапоптозного белка Вах в гиппокампе после введения клонидина или иохимбина. 1 - клонидин, 2 - иохимбин. Остальные обозначения см. на рис. 1. * р < 0.01 по сравнению с контролем и введением иохимбина (LSD критерий Фишера).
Часы
Рис. 4. Изменение уровня мРНК проапоптозного белка каспазы-3 в гиппокампе после введения клонидина или иохимбина. 1 - клонидин, 2 - иохимбин. Остальные обозначения см. на рис. 1. *р < 0.05 по сравнению с контролем (LSD критерий Фишера).
0 24 120
Часы
Рис. 5. Изменение уровня мРНК антиапоптозного белка Bc1-Xl в стволе головного мозга после введения клонидина или иохимбина. 1 - клонидин, 2 -иохимбин. Остальные обозначения см. на рис. 1. *р < 0.04 по сравнению с контролем (LSD критерий Фишера).
кампе 8-суточных животных (влияние препаратов Б(2, 38) = 4.03; р < 0.03; рис. 4).
В стволе мозга стимуляция альфа2-АР клони-дином также повысила уровень мРНК антиапоптозного белка Вс1-Хь на 8-е сут жизни (Б(2, 25) = = 4.12; р < 0.03; рис. 5) по сравнению с введением иохимбина и уровнем контрольных животных.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В работе установлена способность терапевтических доз стимулятора альфа2-АР клонидина или их блокатора иохимбина изменять уровни
мРНК каспазы-3, Вах и Вс1-Хь в клетках, ядра которых находятся в стволе, гиппокампе и коре головного мозга. Матричные РНК синтези
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.