научная статья по теме ЭФФЕКТЫ ЛИГАНДОВ АЛЬФА2-АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ НА УРОВЕНЬ МРНК БЕЛКОВ АПОПТОЗА В ФОРМИРУЮЩЕМСЯ ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫС Биология

Текст научной статьи на тему «ЭФФЕКТЫ ЛИГАНДОВ АЛЬФА2-АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ НА УРОВЕНЬ МРНК БЕЛКОВ АПОПТОЗА В ФОРМИРУЮЩЕМСЯ ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫС»

ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 1, с. 104-109

КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ

УДК 577.171.6:577.323:612.65

ЭФФЕКТЫ ЛИГАНДОВ АЛЬФА2-АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ НА УРОВЕНЬ мРНК БЕЛКОВ АПОПТОЗА В ФОРМИРУЮЩЕМСЯ

ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫС

© 2008 г. Ф. А. Ильиных, А. В. Баннова, Т. С. Калинина, Н. Н. Дыгало

Институт цитологии и генетики СО РАИ, 630090, Иовосибирск, пр. Лаврентьева, 10 E-mail: ifa83@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 04.05.2007 г.

Исследовали эффекты блокатора альфа2-адренорецепторов иохимбина и их стимулятора клониди-на на уровень мРНК, кодируемой генами Bax и Bcl-XL, в головном мозге неонатальных крысят. Через 1 сут после введения иохимбин снижает уровень транскрипта Bax в мозжечке, повышает соотношение уровней мРНК Bcl-XL и Bax в этом отделе, а также в коре и гиппокампе, и увеличивает содержание мРНК Bcl-XL в коре и гиппокампе 6-суточных крысят. Введенный через 20 мин после иохимбина, клонидин предотвращает его действие на уровень мРНК Bcl-XL в гиппокампе. Результаты свидетельствуют, что фармакологическая блокада альфа2-адренорецепторов в развивающемся головном мозге крыс приводит к проявлению антиапоптозных признаков, часть которых снимается при одновременном введении стимулятора этих рецепторов.

Апоптоз, или программируемая гибель клеток, направлен на сохранение нормального функционирования биологических систем и является непременным участником формирования органов и тканей в онтогенезе (Yuan, Yankner, 2000; Bredesen et al., 2006). Основными регуляторами апоптоза, участвующими в развитии головного мозга млекопитающих, являются члены семейства Bcl-2 - антиапоптозный белок Bcl-XL и проа-поптозный белок Bax. Проапоптозные члены этого семейства действуют на внешнюю мембрану митохондрий и индуцируют выход цитохрома c и ряда факторов, участвующих в реализации гибели клетки (Chao, Korsmeyer, 1998; Willis et al., 2003). Антиапоптозные члены семейства блокируют действие проапоптозных белков.

Известно, что апоптоз является неотъемлемым компонентом нормального развития нервной системы млекопитающих (Oppenheim, 1991; Sun et al., 2003). Причинами, которые способны вызвать чрезмерную активацию или, наоборот, торможение программы апоптоза в развивающемся мозге, могут оказаться сигнальные молекулы нейротрансмиттеров, в частности, лиганды альфа2-адренорецепторов (альфа2-AP). Описано нейропротекторное действие как агонистов (Jolkkonen et al., 1999; Zhang, 2004), так и антагонистов этих рецепторов (Gustafson et al., 1989; Bauer et al., 2003) при ишемическом повреждении мозга. Эффекты альфа2-адренолигандов на жизнеспособность клеток мозга в условиях естественного постэмбрионального формирования не исследованы. Кроме того, не определена роль

белков семейства Bcl-2 в процессах, опосредуемых альфа2^Р.

Показано, что стимулятор aльфa2-AP, клонидин, повышает экспрессию гена каспазы-3 и индекс фрагментации ДНК, являющейся классическим признаком апоптоза, в стволе мозга 21-су-точных эмбрионов крыс и 8-суточных животных, обладая, следовательно, проапоптозными свойствами (Dygalo et al., 2004). Однако остается неясным, связаны ли эти эффекты со способностью клонидина активировать альфа2^Р. Выяснение этого вопроса представляется важным, поскольку агонисты альфа2^Р широко используются в клинической практике для перинатальной анестезии и терапии гипертонии (Kamibayashi, Maze, 2000). Влияние внеклеточных сигналов на предрасположенность клетки к запуску программы самоуничтожения остается одним из наиболее сложных и малоизученных аспектов программируемой гибели клеток.

Цель настоящего исследования состояла в изучении действия альфа2-адренолигандов на экспрессию генов ключевых белков апоптоза Bax и Bcl-XL в развивающемся головном мозге крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали крыс линии Вистар, содержащихся в стандартных условиях вивария иЦиГ СО РАН: температура 22-24°С, естественное освещение и свободный доступ к воде и корму. Для получения самок с датированным сроком беременности ссаживали 3 самки и самца. Первы-

ми сутками беременности считались сутки обнаружения спермы во влагалищном мазке, первыми сутками жизни - день родов. Число крысят в каждом помете выравнивалось до восьми особей. На 5-е сутки жизни крысятам подкожно вводили 0.5 или 2 мг/кг антагониста альфа2^Р иохимбина (Sigma, США) в 20 мкл физиологического раствора, или эквивалентный объем физиологического раствора. Каждый помет разделяли на две экспериментальные группы. Через 20 мин после инъекции иохимбина крысятам всех групп вводили подкожно 0.4 мг/кг клонидина (Sigma) в 20 мкл физиологического раствора, или эквивалентный объем физиологического раствора. Средний вес крысят составлял 10 г.

Всего было сформировано шесть групп животных. Каждая группа включала в себя 6-8 животных. Спустя 24 ч после инъекций 6-суточных крысят забивали быстрой декапитацией.

Уровень мРНК определяли полуколичественной ревертивной полимеразно-цепной реакцией (ОТ-ПЦР) в суммарной РНК, выделенной одностадийным гуанидин-изотиоцианатным методом (Chomczynski, Sacchi, 1987) из образцов ткани ствола мозга, коры, гиппокампа и мозжечка. Для получения кДНК использовали Oligo-dT-праймер и обратную транскриптазу (СибЭнзим, Россия). Амплификацию специфичных для каждого гена участков кДНК проводили по стандартной методике (Калинина и др., 2001) с использованием праймеров для Bax (Tamatani et al., 1999), Bcl-XL (Shindler et al., 1997) или бета-актина (Nudel et al., 1983). Уровень мРНК, кодируемой генами Bax и Bcl-XL, оценивали относительно мРНК бета-актина после сканирования в ультрафиолетовом свете продуктов ПЦР (BioDoc II, Biometra GmbH, Германия), разделенных электрофорезом в 1.5%-ном агарозном геле, окрашенным бромистым этиди-ем, и последующей компьютерной денситомет-рии (программа "Scion Image").

Полученные результаты обработаны статистически. Влияние введения иохимбина и клонидина на экспрессию генов Bax и Bcl-XL оценивали двухфак-торным дисперсионным анализом (ANOVA, "Statis-tica"), достоверность различий между группами животных устанавливали по LSD критерию Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе обнаружено изменение количества транскриптов белков семейства Bcl-2 в отделах головного мозга неонатальных крысят под действием адренергических препаратов.

Введение иохимбина в дозе 2 мг/кг снизило уровень мРНК проапоптозного белка Bax в мозжечке (рис. 1, F(2j 45) = 3.22; P < 0.05) и повысило уровень мРНК Bcl-XL в коре головного мозга (рис. 2, F(2, 40) = 3.38; P < 0.05). В результате этих

(а)

1 2 3 4 5 6

Вах

бета-актин

усл. ед.

0.8

0.6

0.4

(б)

0 0.5 2.0

Доза иохимбина, мг/кг

Рис. 1. Влияние иохимбина на уровень мРНК, кодируемой геном Bax, в мозжечке: a - электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР Bax и бета-актина. 1, 2 - группы, не получавшие иохимбин; 3, 4 - введение иохимбина, 0.5 мг/кг; 5, 6 - введение иохимбина, 2.0 мг/кг; 2, 4, 6 - введение клонидина, 0.4 мг/кг. (для рис. 1, 2, 4); б - уровень мРНК Bax относительно бета-актина. По оси ординат - безразмерная величина, отражающая соотношение количеств мРНК Bax и бета-актина. Высота столбцов соответствует средней арифметической, вертикальные линии - ошибка среднего,

* - P < 0.05 по сравнению с контролем (Fisher LSD). Для рис. 1, 2.

изменении произошло смещение соотношения уровней мРНК антиапоптозного белка Bcl-XL и проапоптозного белка Bax в пользу транскрипта Бс1-Хь как в мозжечке (Р(2, 39) = 12.2; Р < 0.0001), так и в коре мозга (рис. 3, 40) = 6.04; Р < 0.005). Низкая доза иохимбина, как и последующее введение агониста рецепторов клонидина, не вызывала существенных изменений уровня транскриптов белков семейства Bcl-2 в мозжечке и коре головного мозга (Р > 0.1).

В гиппокампе под действием большей дозы иохимбина уровень мРНК белка Bcl-XL также возрастал (рис. 4, 35) = 5.73; Р < 0.01), однако, в отличие от мозжечка и коры, действие иохимбина ослаблялось последующим введением 0.4 мг/кг клонидина (рис. 4, взаимодействие организованных факторов: 35) = 4.30; Р < 0.02). Стимуляция рецепторов агонистом возвращала повышенное содержание транскрипта Бс1-Хь в гиппокампе к уровню контрольных животных. Действие клонидина не изменило степень повышения соотно-

(а)

l 2 3 4 5 б

Соотношение мРНК Bcl-XL/Bax 1.4 h ' *

BCÏ-Xl

бета-актин

усл. ед. 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4

(б)

1.2 1.0 0.8 0.6 0.4

■у *

0.5

Доза иохимбина, мг/кг

2.0

0 0.5 2.0

Доза иохимбина, мг/кг

Рис. 2. Влияние иохимбина на уровень мРНК Bcl-XL в коре мозга. а - электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР Bcl-XL и бета-актина, б - уровень мРНК Bcl-XL относительно бета-актина.

шения между транскриптами Bcl-XL и Bax в неона-тальном гиппокампе при введении 2 мг/кг иохимбина (данные не приведены).

Ни блокада альфа 2-АР иохимбином, ни последующее введение клонидина не изменило уровень транскриптов белков Bcl-2 семейства в стволе головного мозга (данные не приведены).

Таким образом, блокада альфа2^Р иохимбином снижает уровень мРНК Bax в мозжечке и повышает уровень мРНК Bcl-XL в коре и гиппокампе, что увеличивает соотношение мРНК Bcl-XL/Bax в мозжечке, коре и гиппокампе; агонист альфа2^Р клонидин ослабляет стимулирующий эффект иохимбина на уровень мРНК Bcl-XL в гиппокампе неонатальных крысят.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Участие альфа2^Р в процессе физиологической гибели клеток мезенхимы явилось основанием предполагать их возможное вовлечение в апоптоз клеток мозга (Wang, Limbird, 1997). Известно, что норадреналин, локально доставляемый аксонами в неокортекс, может регулировать выживание и пролиферацию нейроэпителиаль-ных клеток эмбриона крысы in vitro (Popovik, Hayness, 2000). Кроме того, разрушение норадре-

Рис. 3. Влияние иохимбина на соотношение уровней мРНК Bcl-XL/Bax в коре (1), мозжечке (2) и гиппокампе (3). * - P < 0.05 по сравнению с соответствующим контролем (Fisher LSD).

нергических терминален в коре мозга крыс приводит к увеличению числа клеток Кахаля-Ретци-уса в течение первых двух недель жизни, т.е. но-радренергическая система, по всей видимости, регулирует развитие этих клеток (Naqui et al., 1999). Косвенным свидетельством взаимосвязи адренорецепторов с апоптоз

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»