ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 1, с. 59-67
УДК 581.174.1;611.018.1;631.147;635.64
ЭФФЕКТЫ NaCl, Na2S04 И МАННИТА НА УТИЛИЗАЦИЮ ЗАПАСНОГО КРАХМАЛА И ФОРМИРОВАНИЕ ПЛАСТИД В СЕМЯДОЛЯХ И КОРНЯХ ПРОРОСТКОВ ЛЮЦЕРНЫ
© 2007 г. Е. Н. Баранова, А. А. Гулевич, В. Ю. Поляков
Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук, Москва Поступила в редакцию 14.04.2006 г.
Методом трансмиссионной электронной микроскопии изучали влияние на процессы утилизации запасного крахмала в клетках мезофилла семядоли и корневой меристемы при прорастании семян люцерны (Medicago sativa L.) в растворах NaCl, Na2SO4 и маннита в различных концентрациях, выровненных по осмотическому давлению. Ультраструктурный анализ выявил изменения количества крахмальных зерен и замедление развития хлоропластов в зависимости от осмотического эффекта солевого воздействия. При низких концентрациях, соответствующих осмотическому давлению 202.6 кПа, Na2SO4 не влиял на развитие фотосинтетического аппарата и утилизацию крахмальных включений; маннит способствовал сохранению значительных запасов крахмала, не нарушая развитие хлоропластов; NaCl не препятствовал развитию фотосинтетического аппарата, в его присутствии увеличивалось содержание крахмальных зерен - предположительно за счет вновь синтезированного крахмала. При повышении концентрации до значения, соответствующего давлению в 607.8 кПа, NaCl не препятствовал превращению амилопластов в хлоропласты и утилизации крахмала, Na2SO4 ингибировал и развитие хлоропластов, и утилизацию крахмала, а маннит вызывал замедление превращения амилопластов и ингибирование мобилизации крахмальных зерен. Полученные результаты позволяют предложить метод предварительной оценки устойчивости двудольных растений к абиотическим стрессам на основе цитологического анализа утилизации крахмальных зерен и формирования фотосинтетических компартментов хлоропластов в мезофилле семядолей.
Medicago sativa - крахмальные зерна - утилизация крахмала - хлоропласты - амилопласты -этиопласты - прорастание - засоление - ультраструктура
ВВЕДЕНИЕ
На ранних этапах ювенильной стадии развития растений запасные вещества вовлекаются в метаболизм и используются при построении клеточных структур и для поддержания энергетических потребностей развивающихся проростков [1]. У большинства двудольных растений основные резервы сосредоточены в семядольных листьях и в меньшей степени в других частях семени, например, в первичном корне, а соотношение и распределение различных резервов может сильно варьировать у разных видов растений [2]. В семенах бобовых содержится значительное количество запасного белка в виде белковых тел [3]; липидов -триацилглицеринов, окруженных фосфолипид-ной оболочкой, в виде специфических запасаю-
Адрес для корреспонденции: Баранова Екатерина Николаевна. 127550 Москва, ул. Тимирязевская, 42. Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН. Факс: 007 (495) 977-16-36; электронная почта: greenpro@iab.ac.ru
щих компартментов - олеосом [4]; полисахаридов в виде крахмальных зерен, депонированных в амилопластах [5]. Наибольшим изменениям в семядолях подвергаются пластиды [2].
В сухих и набухающих семенах бобовых в пластидах (амилопластах) содержатся зерна крахмала. При прорастании семян de novo синтезируются а-амилаза и другие ферменты, ответственные за расщепление крахмала [6]. Хотя у высших растений крахмал синтезируется внутри пластид (хлоропластов, амилопластов, этиопластов), его предназначение будет зависеть от типа пластид и растительной ткани, в которой они расположены [7]. При преобразовании пластид в семядолях не только утилизируются крахмальные гранулы, но и формируется полноценный фотосинтезирую-щий хлоропласт, содержащий тилакоидный комплекс (граны), ламеллярный комплекс и строму с крахмальными зернами или без них [7]. В пластидах семядолей до прорастания семени, на начальных этапах их развития и при возрастной перестройке, в связи со старением или адаптацией к неблагоприятным условиям, могут наблюдаться
другие включения, содержащие запасные вещества: осмиофильные липопротеиновые частицы -пластоглобулы, содержащие различные структурные белки и ферменты и являющиеся, в частности, местом синтеза токоферола [8], а также другие запасные вещества, например, ферритин, метаболизируемые при преобразовании пластид [9, 10].
Известно, что первичным продуктом фотоассимиляции углерода являются сахара. В темновой фазе фотосинтеза сахара, запасаемые в виде полисахаридов и откладываемые в крахмальных зернах, снова конвертируются в свободные сахара и могут поставляться на нужды клеток других нефотосинтезирующих тканей растения. Соотношение процессов биосинтеза крахмала и сахаров варьирует в зависимости от условий окружающей среды [6]. В настоящее время большое внимание уделяется изменениям фотоассимилирующей системы и запасающей функции хлоропласта в условиях засоления [11].
Полученные разными исследователями данные достаточно противоречивы, что, вероятно, связано со специфическими реакциями на воздействие стресс-факторов у разных растений. Так, установлено, что у обработанных NaCl растений гороха структура тилакоидов хлоропластов становится дезорганизованной, увеличивается размер и количество пластоглобул, а содержание крахмала уменьшается [12]. В мезофилле листьев батата при усилении солевого стресса тилакоид-ные мембраны хлоропластов "раздуваются" и по большей части исчезают [13]. Уменьшение количества и размера стопок гран при одновременном разбухании тилакоидов описано при солевом стрессе у листьев картофеля [14]. Изменения в ультраструктуре хлоропластов, выражавшиеся в присутствии крупных крахмальных зерен, почти полном отсутствии гран и разбухании тилакоидов на фоне увеличения размеров клеток мезофилла, обнаружены у Eucalyptus microcorys [15]. В результате солевого стресса отмечали дезорганизацию структуры тилакоидов в хлоропластах листьев Bruguiera parviflora [16]. Исследования, проведенные на растениях Mesembryanthemum crystallinum, выявили изменения в структуре запасных веществ хлоропласта, таких как крахмал, фитин и ферритин [17]. Результаты наблюдений, проведенных на пластомных мутантах горчицы, выявили зависимость, позволившую авторам предложить методику оценки солеустойчивости по изменению содержания крахмальных зерен в хлоропластах листа [18].
Исследования как формирующихся, так и зрелых листьев позволяют анализировать изменения, происходящие под действием различного рода стрессоров, однако требуют проведения множества морфометрических измерений. Информатив-
ность подобных исследований можно увеличить, если в качестве модели использовать семядольный лист, в котором, помимо процессов роста, свойственных настоящему листу, происходит также превращение нефотосинтезирующей пластиды в фотосинтезирующую и утилизация запасных веществ, отложенных в пластоглобулах и в крахмальных зернах [19]. Кроме того, дополнительным важным показателем интенсивности метаболизма полисахаридов может служить динамика крахмальных зерен в пластидах корня.
При прорастании семена часто оказываются под влиянием различных негативных абиотических факторов, таких как понижение температуры, засуха и засоление. В условиях засоления тормозится прорастание семян [20], рост и развитие проростков [21]. Известно, что соли оказывают как осмотическое, так и токсическое воздействие [22, 23]. Хотя имеется немало работ, в которых детально исследованы эффекты засоления и солевого стресса на ультраструктуру пластид развитых фотосинтезирующих тканей [17], влиянию солевого и осмотического воздействий на утилизацию запасных веществ и на преобразование пластид запасающих тканей не уделялось внимания.
Настоящее исследование было проведено, чтобы изучить различия в превращении пластид в клетках семядоли люцерны (амилопластов в хло-ропласты) и меристематической зоны корня (запасающих пластид в амилопласты и лейкопласты) с учетом утилизации крахмала, депонированного в виде крахмальных зерен, под воздействием изоосмотических концентраций NaCl, Na2SO4 и маннита.
МЕТОДИКА
В качестве объекта использовали развивающиеся проростки люцерны посевной (Medicago sativa L., сорт Надежда). Осмотический стресс индуцировали NaCl, Na2SO4 и маннитом. Для унификации условий воздействия концентрации реагентов выравнивали по осмотическому давлению до 202.6, 405.2 и 607.8 кПа, в соответствии со стандартной методикой ВИР [24].
Семена проращивали в темноте при 20-25°С (1 сутки) и далее в условиях 12-часового фотопериода при 17-18°С в темноте и 20-25°С на свету, в водных растворах солей в чашках Петри (по 100 семян на чашку). Для электронно-микроскопического анализа использовали листья семядолей и корни 4- и 8-дневных проростков. В качестве контроля использовали те же органы проростков, взятые на 2-, 4- и 8-е сутки после прорастания на дистиллированной воде.
Для электронной микроскопии фрагменты семядольных листьев шириной 0.5-1.0 мм и длиной 1-2 мм, а также корни длиной около 1 см фикси-
ровали 4 ч при комнатной температуре в 2%-ном растворе глутарового альдегида на 0.1 М фосфатном буфере с добавлением сахарозы (15 мг/мл, pH 7.2). Постфиксацию материала проводили в 1%-ной четырехокиси осмия на том же буфере в течение 2 ч. Дегидратацию и заключение материала в эпоксидную смолу проводили по стандартной методике. Ультратонкие срезы готовили на микротоме LKB-V ("LKB", Швеция). Срезы окрашивали цитратом свинца и просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе H-300 ("Hitachi", Япония) при ускоряющем напряжении 100 кВ и рабочем увеличении Х10000.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Клетки мезофилла семядоли
Для сравнительного анализа динамики мобилизации крахмальных зерен в пластидах были изучены клетки мезофилла семядоли на 8-е сутки и меристематической зоны корня проростков на 4-е сутки после прорастания семян.
Контроль. При проращивании семян на воде на 2- и 4-е сутки пластиды всех тканей семядоли представляли собой амилопласт (рис. 1а, 16) с начинающей развиваться на 4-е сутки ламеллярной сист
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.