НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 2, с. 152-157
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.164+577.115+612.82
ЭФФЕКТЫ ПРОИЗВОДНЫХ ПАНТОТЕНОВОЙ КИСЛОТЫ НА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ И УРОВЕНЬ КОРТИКОСТЕРОНА В ГИППОКАМПЕ И НЕОКОРТЕКСЕ КРЫС ПРИ ИНТЕРОЦЕПТИВНОМ СТРЕССЕ
© 2013 г. М. Ю. Степаничев1, *, М. В. Онуфриев1, А. К. Пискунов1, Ю. В. Моисеева1, Н. А. Лазарева1, А. Г. Мойсеенок2, П. В. Гусев1, Н. В. Гуляева1
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности
и нейрофизиологии Российской академии наук, Москва, Россия 2Государственное учреждение "Научно-производственный центр "Институт фармакологии и биохимии
НАНБеларуси"", Гродно, Беларусь
В работе проведено исследование эффектов интероцептивного стресса на показатели свободнора-дикального окисления и уровень кортикостерона в мозге и крови самцов крыс. Кроме того, изучали влияние ГАМК-подобного ноотропа гопантената кальция и пантенола на эти показатели при стрессе. Интероцептивный стресс индуцировали интраперитонеальной инъекцией бактериального ли-пополисахарида; исследование проводили через 24 ч после инъекции. Производные пантотеновой кислоты существенно снижали селективное накопление кортикостерона в гиппокампе при интеро-цептивном стрессе, вызванном системной иммунной провокацией, но не предотвращали вызванное стрессом накопление продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в крови животных.
Ключевые слова: гиппокамп, интероцептивный стресс, гопантенат кальция, пантенол, липополисахарид.
DOI: 10.7868/S1027813313020064
ВВЕДЕНИЕ
Важная роль гиппокампа в организации ответа организма на стресс обусловлена несколькими факторами. Во-первых, среди отделов мозга гиппокамп имеет максимальную плотность кортико-стероидных рецепторов, с которыми взаимодействуют глюкокортикоиды, поступающие в кровь при стрессе [1, 2]. Во-вторых, стресс, особенно хронический, или введение кортикостероидов приводят к структурной модификации нейронов гиппокампа, которая наиболее выражена в пирамидном слое поля СА3 [3—6]. В-третьих, хронический стресс активирует провоспалительные процессы в гиппокампе, которые, при отсутствии должного контроля, могут оказывать повреждающее воздействие и нарушать его функционирование [7—10]. В-четвертых, хронический стресс или введение кортикостероидов могут вызывать гибель клеток гиппокампа, включая гибель специфических популяций нейронов, что может негативно влиять на его участие в когнитивных процессах [11, 12]. Наконец, в-пятых, гиппокамп оказывает тормозное влияние на нейросекретор-
*Адресат для корреспонденции: 117485 Москва, ул. Бутлерова, 5 А; тел./факс: +7 (495) 952-40-07; e-mail: m_step@pochta.ru.
ные клетки гипоталамуса, ответственные за секрецию кортикотропин-рилизинг-фактора, тем самым, осуществляя регуляцию нейроэндокрин-ного ответа на стресс по принципу отрицательной обратной связи [13—15].
Согласно классическому определению Г. Се-лье, стресс — это "неспецифический ответ организма на любое предъявленное ему требование" [16]. Такой стереотипный ответ может возникать как реакция на нейрогенные воздействия эмоциональной, психогенной и/или иной природы и на системные воздействия, связанные с изменением гомеостатических или физиологических параметров [17]. Принято считать, что различия этих стрессорных ответов обусловлены не только особенностями действующих факторов, но и характером восприятия стрессорного воздействия (со-матосенсорные/ноцицептивные и висцеральные механизмы, соответственно) [18]. В связи с этим разные по природе формы стресса принято называть экстероцептивным или интероцептивным стрессом, соответственно. Было показано, что на уровне ЦНС общим конечным путем для реализации ответа, как на экстероцептивный, так и на интероцептивный стресс являются висцеромо-
торные нейроны паравентрикулярного ядра гипоталамуса [19].
В условиях экстероцептивного стресса именно гиппокамп вместе с медиальной частью префрон-тальной коры оказывает тормозное влияние на нейроэндокринный компонент стресс-реакции через нейроны паравентрикулярного ядра [15]. Существенно меньше известно о роли гиппокам-па в центральных механизмах реализации ответа на интероцептивный стресс. При этом показано, что хроническое введение бактериального липо-полисахарида (ЛПС) мышам, модель интероцеп-тивного стресса, ведет к нарушению гиппокамп-зависимых форм обучения и памяти [20]. Это связано, в частности, со спецификой развития ней-ровоспалительных процессов в гиппокампе, в результате чего происходит увеличение продукции Р-амилоидного пептида [20, 21] и избыточное фосфорилирование т-белка [22]. Даже однократное введение ЛПС приводит к активации микро-глии в гиппокампе, сопровождающейся продукцией провоспалительных цитокинов и снижением экспрессии трофических факторов [23]. Ранее мы показали, что интраперитонеальная инъекция ЛПС вызывает более заметные изменения экспрессии интерлейкина-1р и эритропоэтина в гиппокампе по сравнению с префронтальной корой и другими отделами неокортекса, причем эти изменения были максимально выражены через 24 ч после введения эндотоксина [24].
Целью этой работы было исследование соотношения содержания гормона стресса, кортико-стерона, в неокортексе и гиппокампе, а также в крови крыс после однократной инъекции ЛПС. Учитывая, что ингибирующий эффект гиппокам-па на нейроны гипоталамуса опосредован ГАМ-Кергическими влияниями [15], мы исследовали эффекты ГАМК-подобного производного панто-теновой кислоты, гопантената кальция (ГПК), на уровни кортикостерона и свободнорадикальные процессы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали 20 самцов крыс линии Вистар массой 300—420 г (питомник "Столбовая", Московская обл., Россия). Животных содержали в условиях вивария по 5 особей в клетке при свободном доступе к воде и пище и искусственном 12-часовом световом цикле. Крыс случайным образом делили на 4 группы по 5 особей. Экспериментальный протокол был одобрен Этической комиссией ИВНД и НФ РАН.
В первый день крысы групп 1 (контроль) и 2 (вода) получали перорально по 400 мкл дистиллированной воды, а крысы групп 3 (ГПК) и 4 (пантенол) по 400 мкл раствора ГПК (любезно предоставлен ООО "Пикфарма", Россия) в дозе
400 мг/кг. Вещество вводили дважды с интервалом 6 ч. Во второй день животные получали однократное пероральное введение веществ в тех же дозах. Кроме того крысы группы 4 получали дополнительную инъекцию раствора D-пантенола (ПЛ, Jenapharm, Германия) в дозе 200 мг/кг. Через 1 ч после введения веществ крысы группы 1 получали инъекцию изотонического раствора NaCl (2 мл/кг), а три другие группы животных были инъецированы однократно ЛПС из E.coli (серо-тип 026:В6, Sigma, США) в дозе 1 мг/кг.
Через 24 ч после введения ЛПС крыс декапи-тировали, мозг вынимали, разделяли на структуры (новая кора и гиппокамп), промывали в изотоническом растворе NaCl и замораживали в жидком азоте. Кровь после декапитации собирали и сыворотку получали путем центрифугирования при 1500 g в течение 15 мин. Образцы хранили при —85°С до использования.
Образцы ткани мозга гомогенизировали (тефлон-стекло) в 25 мМ HEPES рН 7.4 (1 : 4), содержащем ингибиторы протеаз (пепстатин, лейпеп-тин, апротинин — по 10мкг/мл, PMSF — 1мМ) и небольшие количества ионных (ЭДТА, ЭГТА — по 1мМ) и неионных (CHAPS — 0.1%) детергентов, а также MgCl2 (5мМ). Гомогенат центрифугировали при 12000 g в течение 30 мин при 4°С, су-пернатант отбирали для определения содержания кортикостерона (КС), активности NO-синтазы,
суммарного уровня нитратов и нитритов (NO-) и белка. Содержание КС в сыворотке крови и су-пернатантах ткани мозга определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью наборов "Corticosterone (Rat/Mouse) ELISA" (DRG, Германия). В сыворотке крови и гомогенатах ткани мозга определяли содержание продуктов окислительного стресса, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП) по методу [25]. Активность NO-синтазы (NOS) в ткани мозга оценивали по степени превращения [3Н]^-аргинина в [3Н]^-цитрулин по методу [26] с небольшими модификациями [27]. Суммарный уровень нитратов и нитритов определяли, измеряя интенсивность флюоресценции 2,3-диаминонафтотриазола, который образуется в результате реакции с 2,3-диаминонафталином в кислых условиях [28, 29].
В работе использованы реактивы фирм Sigma (USA), Serva (FRG), Реахим (Россия) градации не ниже ХЧ.
Статистическую обработку результатов проводили с применением непараметрических методов анализа. Для сравнения независимых переменных использовали ^-критерий Манна—Уитни. Анализ проводили с помощью программного пакета Statistica for Windows, V 6.0.
154
СТЕПАНИЧЕВ и др.
160
140
120
л 100
ол
§ 80
н
и 60
К
40
20
0
80
60
40
20
Контроль Вода
1---г
ГПК ГПК + ПЛ
ЛПС (1 мг/кг)
Рис. 1. Эффекты интероцептивного стресса и производных пантотеновой кислоты на уровень кортико-стерона (а), продуктов окислительного стресса (б) и метаболитов N0 (в) в сыворотке крови крыс. * — р < < 0.05, ** — р < 0.01 по сравнению с контролем.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эффекты интероцептивного стресса. Усиление процессов свободнорадикального окисления, как правило, является неотъемлемой частью воспалительных процессов, в том числе вызванных системным введением бактериального ЛПС
[23, 30, 31]. Поэтому для характеристики эффектов однократного введения ЛПС на уровне организма в целом мы исследовали содержание ТБКРП и суммарное содержание нитритов и нитратов как конечного продукта метаболизма NO (рис. 1б, в). Как видно из представленных данных, через 24 ч после введения ЛПС в дозе 1 мг/кг уровень ТБКРП в сыворотке крови сохранялся повышенным. В то
же время содержание NO- не отличалось у крыс контрольной и подопытной групп из-за достаточно высокой вариабельности показателей у животных, получавших ЛПС. Достоверных различий в содержании КС в крови также не было обнаружено через 24 ч после воздействия (рис. 1а). В целом эти данные согласуются с имеющимися представлениями о характере развития ответа на системное введение ЛПС.
Те же показатели были исследованы в гиппо-кампе и неокортексе экспериментальных животн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.