ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 3, с. 354-357
УДК 577152.3
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОЦЕНКИ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ВАЗОДИЛАТАТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ОРГАНИЧЕСКИХ НИТРАТОВ
© 2007 г. Л. А. Сырцова, Б. Л. Психа, Е. С. Малкова, Н. И. Шкондина, А. И. Котельников
Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка, Московская обл., 142432
e-mail: syrtsova@icp.ac.ru Поступила в редакцию 17.07.2006 г.
На примере 3,3-бис(нитроксиметил)оксетана (НМО) исследована кинетика взаимодействия органических нитратов с цистеином (Цис) по скорости образования нитрит-иона при различных концентрациях реагентов и рН. Проведено сравнение природных восстановителей - Цис, глутатиона, НАДН по скорости образования ими нитрит-иона из органических нитратов на примере НМО. Лучшим восстановителем оказался Цис. Сравнение эффективностей нитратов (3 мМ) - тринитроглице-рина, НМО и никорандила в реакции с Цис (10 мМ) показало, что скорость накопления нитрит-иона составляет соответственно 1.66, 0.37, 0.02 мкМ/мин. Реакция органического нитрата с Цис может использоваться как тестовая система для анализа эффективности нитратов в реакции образования нитрит-иона, которая коррелирует с их вазодилататорной активностью (расширение кровеносных сосудов).
Органические нитраты - наиболее известный класс вазодилататоров - являются донорами NO. Для восстановления нитрата в NO нужны 3 электрона, 2 из которых расходуются при превращении нитроэфирной группы в нитрит-ион. Затем с расходом одного электрона нитрит-ион переходит в NO. Передать 3 электрона в одном элементарном акте нельзя, поэтому при восстановлении органических нитратов прежде всего образуется нитрит-ион. В живом организме есть целый ряд ферментативных и неферментативных восстановителей, которые проводят эту реакцию.
Известно, что монооксид азота (NO) является уникальным биологическим регулятором, в частности, стимулирует расширение кровеносных сосудов, выполняет функции посредника в межклеточных взаимодействиях, цитотоксического эффектора иммунологической защиты организма, регулятора нейротрансмиссии, иммунитета, ингибитора агрегации тромбоцитов и их адгезии на стенках кровеносных сосудов [1]. Данные о многофункциональной биологической активности NO in vivo используются при разработке фундаментальных основ создания нового поколения лекарственных препаратов, применяемых в терапии сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Основным механизмом действия NO в регуляции тонуса кровеносных сосудов является координация NO гемом гуанилатциклазы (КФ 4.6.1.2) [2, 3]. Активация этого важного регуляторного фермента, как известно, протекает по гемзависимому механизму с накоплением цГМФ. Последний активирует цГМФ-зависимую протеинкиназу (КФ 2.7.1.37), а также Са2+-АТФазу, в свою очередь, участвующую в дефосфорилировании легких цепей миози-
на, что приводит к выходу Са2+ из клеток мышц и, в конечном счете, к вазодилатации.
Лечебный эффект наиболее известных вазодилататоров - тринитроглицерина (ТНГ), нитро-сорбида - обусловлен действием N0, образующимся в результате их биотрансформации. Известно, что в процессе метаболизма ТНГ и другие органические нитраты дают в качестве первого продукта нитрит-ион [4]. В случае ТНГ эта реакция катализируется альдегиддегидрогеназой (КФ 1.2.1.3) или дезоксигемоглобином (НЬ) и рядом других ферментов [3]. В последние пять лет накоплен большой экспериментальный материал, свидетельствующий о том, что нитрит-ион, присутствующий в крови в концентрации 300 нМ [5], представляет собой самый большой источник для получения N0 внутри сосудов и тканей. Нитрит-ион превращается в N0 путем реакции с НЬ и другими гемсо-держащими белками, а также с ксантиноксидоре-дуктазой (КФ 1.2.3.2) и различными тиолсодержа-щими ферментами [3]. Для направленного поиска и создания новых эффективных лекарственных препаратов необходимо иметь надежный тест для выявления потенциальных доноров N0. Есть данные литературы, свидетельствующие о том, что скорость образования нитрит-иона из органических нитратов коррелирует с их вазодилататорной активностью [6].
Цель исследования - разработка тестовой системы для анализа эффективности органических нитратов как доноров N0, исследование тестовой системы на основе органического нитрата и цистеи-на (Цис), сравнение эффективности ТНГ, 3,3-бис(нитроксиметил)оксетана (НМО), рис. 1) и N (2-нитроксиэтил)никотинамида (НКР) в реакции
с Цис по анализу скорости накопления нитрит-иона (рис. 1).
МЕТОДИКА
Материалы. В работе использовали Цис, НАДН, глутатион, аскорбат натрия, п-оксимерку-рибензоат, сульфаниламид (СА, "Sigma", США), ^(1-нафтил)этилендиамин (НЕДА, "MP Biomedicals", Германия). Диметилсульфоксид (ДМСО, "Химмед", Россия) ч.д.а. дополнительно очищали перегонкой при 10 мм рт. ст., собирая фракцию, кипящую при 73-75°С. НМО и НКР были синтезированы А.М. Королёвым по методике [7].
Техника работы в атмосфере азота. Операции проводили в атмосфере азота высокой чистоты, который дополнительно очищали пропусканием через колонку с хромо-никелевым катализатором. Используемые сосуды были герметизированы с помощью резиновых затворов Rubber Septa ("Sigma", США), позволяющих вводить через иглу газ или нужные компоненты. С целью перевода рабочих растворов (буфер, ДМСО, растворы реагентов) в атмосферу азота сосуды с растворами предварительно вакуумировали, а затем с помощью длинных стальных игл пропускали азот через растворы при перемешивании на магнитной мешалке в течение 30-40 мин. Для перенесения раствора из одного сосуда в другой его переводили под избыточным давлением азота посредством двух игл, соединенных тефлоновыми капиллярами. Избыточное давление сбрасывали через иглу, на которую был надет тефлоновый капилляр, погруженный в воду. Сосуды объемом 4-14 мл с навесками нитратов или с растворами других реагентов продували через иглы азотом по 30 мин.
Исследование кинетики взаимодействия органических нитратов с Цис и другими восстановителями. Реакцию проводили в атмосфере азота в стеклянном сосуде объемом 20 мл с термостати-руемой рубашкой, снабженном резиновым затвором. Реакционный сосуд и каждый из компонентов реакции предварительно переводили в атмосферу азота, как описано выше. Раствор Цис (20 мМ) приготавливали из хлоргидрата Цис, растворяя его в 0.05 М фосфатном буфере, рН 7.0, и доводя до рН 7.0 раствором 1 н. NaOH. В работе использовали свежеприготовленный раствор Цис, причем его концентрацию выверяли титрованием п-ок-симеркурибензоатом [8]. Растворы НМО и НКР (90 мМ) приготавливали растворением этих веществ в ДМСО. Реакцию начинали введением нитрата и проводили при 25°С при перемешивании на магнитной мешалке. Конечная концентрация ДМСО в реакционной системе 3.3%. Через определенные интервалы времени отбирали аликвоты реакционной системы по 0.2 мл шприцем через резиновый затвор и замораживали, вводя отбор в
/CH2 CH2-ONO2
O C O\ 'C\
CH2 ch2-ono2
1
N I
H
.(CH2)2-ONO2
Рис. 1. Структурные формулы соединений. 1 - НМО, 2 - НКР.
пробирку, погруженную в жидкий азот. До анализа на нитрит пробирки с отборами хранили при -18°С.
Определение нитрит-иона. Количество нитрит-иона определяли по реакции Грисса при взаимодействии нитрит-иона с СА и НЕДА [9]. Аликвоты реакционной системы размораживали и прибавляли растворы СА и НЕДА. По нашим данным, реакция завершалась через 50 мин при 20°С. Далее измеряли поглощение при 548 нм и рассчитывали концентрацию нитрит-иона по калибровочной кривой, которую строили на основании эксперимента с нитритом натрия.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Из литературы известно, что Hb восстанавливает ТНГ до нитрит-иона [10]. Однако было обнаружено, что Hb восстанавливает не все органические нитраты. Наши опыты показали, что он не восстанавливает НМО и НКР. В то же время, согласно Коноваловой и сотр. [11], НМО увеличивает эффективность цитостатической терапии опухолей. Известно также, что НКР находит применение в кардиологической практике [12, 13]. Поэтому была поставлена задача выяснить, может ли НМО в реакционной системе, близкой к физиологической, т.е. в присутствии природного восстановителя, образовывать нитрит-ион.
Имеются данные, свидетельствующие о том, что скорость образования нитрит-иона из органических нитратов коррелирует с их вазодилататор-ной активностью [6]. Поэтому достаточно иметь надежный тест для анализа скорости образования нитрит-иона из органических нитратов, чтобы судить об их эффективности как вазодилататоров. Нами была изучена реакция образования нитрит-иона из НМО в присутствии природных восстановителей - Цис, глутатиона, аскорбата и НАДН (рис. 2). В контрольных опытах определяли влияние этих соединений на реакцию Грисса с нитритом натрия. Три первых восстановителя не влияли на реакцию, а НАДН оказывал ингибирующее действие. Поэтому в случае НАДН скорость реакции определяли спектрофотометрически по убыли НАДН. Лучшим восстановителем оказался Цис - аналог тиолового кофактора альдегид-дегидрогеназы.
356
СЫРЦОВА и др.
[NO-], мкМ/мин 0.4
Рис. 2. Скорости восстановления НМО восстановителями различной природы. 1 - Цис, 2 - глутатион, 3 -аскорбат натрия, 4 - НАДН. Концентрация HMO 3 мМ, восстановителей 10 мМ. Условия: растворитель 0.05 М фосфатный буфер рН 7.0, содержащий 3.3% ДМСО, температура 25°.
[NO-], мкМ/мин 1.6
1.2 0.8 0.4
1
2
3
Рис. 3. Скорости восстановления органических нитратов Цис. 1 - ТНГ, 2 - HMO, 3 - НКР. Концентрации нитратов 3 мМ, Цис 10 мМ. Условия как в подписи к рис. 2.
[NO-], мкМ 120
90
60
.Л 1
А/
/
<3
30 - ./шг
0 El--•--■•■ I 1 1 4 |
0 100 200 300 400
мин
Рис. 4. Кинетика накопления нитрит-иона в системе НМО-Цис. 1 - НМО 3 мМ, Цис 10 мМ; 2 - НМО 3мМ, Цис 5 мМ; 3 - НМО 1.5мМ, Цис 5 мМ; 4 - НМО 1.5 мМ, Цис 1 мМ. Условия как в подписи к рис. 2.
Далее был исследован процесс образования нитрит-иона в реакции Цис с ТНГ, НМО и НКР и проведено сравнение эффективностей нитратов (3 мМ) - ТНГ, НМО, НКР в реакции с Цис (10 мМ). Скорость накопления нитрит-иона для ТНГ, НМО и НКР составляет соответственно 1.66, 0.37, 0.02 мкМ/мин (рис. 3). Эта система органический нитрат-цистеин может испо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.