ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2010, том 57, № 3, с. 433-440
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.1
ЭКСПРЕССИЯ 1-ЦИС ПЕРОКСИРЕДОКСИНА В МОРФОГЕННЫХ И НЕМОРФОГЕННЫХ КАЛЛУСАХ ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ © 2010 г. А. Н. Акулов*, А. Ю. Скрипников**, Н. И. Румянцева*
*Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук, Казань **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 04.12.2008 г.
С использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии белок с мол. м. 24.5 кД и изоэлектрической точкой 7.5, выявленный с помощью двумерного гель-электрофореза в спектре растворимых белков морфогенных каллусов гречихи татарской Fagopyrum ?Шапеыт Gaertn., идентифицирован как 1 -Цис пероксиредоксин. Экспрессию этого белка наблюдали только в морфогенных культурах и, вероятно, она была связана с наличием проэмбриональных клеточных комплексов.
Ключевые слова: Fagopyrum 1а1апеыт — морфогенный каллус — неморфогенный каллус — проэмбриональ-ный клеточный комплекс — двумерный электрофорез — MALDI-TOFмасс-спектрометрия — 1-Цис пе-роксиредоксин
ВВЕДЕНИЕ
Синтез АФК, таких как супероксид-анион, синглетный кислород, гидроксил радикал и перекись водорода, происходит в течение всего онтогенеза растений. Основными источниками АФК в клетках растений являются электрон-транспортные цепи хлоропластов и митохондрий, фотодыхание в пероксисомах, реакции детоксификации, катализируемые цитохромами в цитоплазме и эндоплазматическом ретикулуме. При воздействии стрессоров количество АФК в клетке может значительно увеличиваться вследствие активации НАДФ Н оксидазы в плазмалемме, окса-латоксидаз (терминов) и пероксидаз в клеточных стенках [1]. Для защиты от разрушительного действия АФК на мембранные структуры и ДНК в клетках растений в ходе эволюции появилась сложная система, представленная как ферментативными, так и неферментативными антиокси-дантами. Пероксиредоксины относятся к относительно недавно (12 лет назад) выявленным ферментам антиоксидантной защиты растений [2]. Они представляют собой тиоловые, негемовые пероксидазы и катализируют разрушение различных перекисей, в том числе гидроперекисей фос-
Сокращения: ПЭКК — проэмбриональный клеточный комплекс; 1-Цис ПР — 1-Цис пероксиредоксин; ИЭФ-буфер — буфер для изоэлектрического фокусирования; CHAPS — 3-[(холаминопропил)-диметиламмоний]—1-пропансульфонат; ФМСФ — фенилметилсульфонилфторид; ТФУ — трифторук-сусная кислота.
Адрес для корреспонденции: Румянцева Наталья Ивановна. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН. Электронная почта: nat_rumyantseva@mail.ru
фолипидов и пероксинитритов [3]. Для всех пе-роксиредоксинов характерно наличие в аминокислотной последовательности каталитического центра одного или двух остатков цистеина. Пероксиредоксины растений подразделяют на четыре класса: 1-Цис пероксиредоксины, 2-Цис пероксиредоксины, пероксиредоксины Q и пероксиредоксины второго типа (тип II пероксиредоксины), согласно данным анализа аминокислотной последовательности (а именно, числу и положению консервативных цистеинов) и механизму катализа разрушения перекиси водорода [4]. Недавно Rouhier и Jacquot [5] предложили выделить пятую группу пероксиредоксинов, в которую входят глутатионпероксидазы, имеющие цистеин в каталитическом центре и обладающие тиоредоксин-зависимой активностью.
Пероксиредоксины в клетках растений имеют множественную локализацию: в цитозоле, перок-сисомах, митохондриях, ядре и хлоропластах [4]. Пероксиредоксины животных вовлечены в регуляцию различных клеточных функций, включая апоптоз [6], клеточную пролиферацию и дифференциацию [7, 8]. Функции пероксиредоксинов растений изучены значительно слабее. Показано их участие в защите клеток от окислительного стресса и имеются серьезные основания рассматривать пероксиредоксины в качестве компонентов редокс-сигналинга [3, 4].
Среди изученных пероксиредоксинов растений 1-Цис пероксиредоксины (1-Цис ПР) экс-прессируются преимущественно в тканях семени. Показано, что гены 1-Цис ПР pBS128 Bromus seca-linus [9], Perl Hordeum vulgare [10], AtPERl Arabi-dopsis thaliana [11—13], FePerl Fagopyrum esculen-
Рис. 1. Каллусные культуры гречихи татарской.
а — морфогенный каллус линии 1-8, б — неморфогенный каллус линии НК-65. На рис. 1а в кадре слева внизу показаны два ПЭКК морфогенного каллуса линии 1-8; масштаб такой же, как и для всей фотографии.
tum [14] экспрессируются в различных тканях семени, преимущественно в алейроновом слое эндосперма и зародыше на поздних стадиях развития. Экспрессия 1-Цис ПР при развитии семени A. thaliana является транзиентной, но более ранняя и длительная экспрессия наблюдается в районе халазы и алейроновом слое [12].
Недавно было показано, что 1-Цис ПР является одним из 16 маркерных белков, синтез которых значительно усиливается в ходе соматического эмбриогенеза на листовых эксплантах люцерны (Medicago truncatula) и связан с формированием соматических зародышей [15].
Морфогенные культуры многих видов растений имеют проэмбриональные клеточные комплексы (ПЭКК), которые рассматриваются как соматические проэмбрио, остановленные в развитии добавлением ауксина в среду культивирования. Если экспрессия 1-Цис ПР связана как с соматическим, так и зиготическим эмбриогенезом, мы можем a priori предполагать, что морфогенные и неморфогенные культуры, не имеющие ПЭКК, могут отличаться по наличию этого белка. В связи с этим, целью нашей работы было изучение экспрессии 1-Цис ПР в морфогенных и не-морфогенных каллусах гречихи татарской, которые являются удобной модельной системой для изучения процессов дифференцировки и морфогенеза in vitro [16, 17].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В нашей работе мы использовали две линии морфогенной и одну линию неморфогенной кал-лусных культур гречихи татарской (Fagopyrum ta-taricum (L.) Gaertn.). Линии морфогенного каллуса 1-8 и 12-5 были получены из незрелых зародышей гречихи татарской и поддерживались in vitro в течение 3 и 8 лет соответственно. Обе морфогенные культуры имели типичный нодулярный мор-фотип и состояли из ПЭКК и "мягкого" каллуса
(рис. 1а). Морфогенные каллусы сохраняли морфологию, диплоидное число хромосом и способность к эмбриоидогенезу и геммогенезу в течение длительного времени культивирования (несколько лет) [18]. Неморфогенный каллус линии НК-65 (рис. 1б), состоящий только из клеток паренхимного типа, был отселектирован как клон, сформированный на морфогенном каллусе, и отличался от него рыхлой структурой, высокой скоростью роста, значительной генетической вариабельностью (хромосомные числа от 1n до 8n) и полной утратой способности к морфогенезу. Эта линия поддерживается in vitro в течение 8 лет. Каллусные культуры выращивали в темноте при температуре 26 ± 1°С на среде RX [18], содержавшей минеральные соли среды Гамборга В5 [19] с добавлением (мг/л): тиамина — 2, пири-доксина — 1, никотиновой кислоты — 1, гидролизата казеина - 2000, 2,4-Д - 2, ИУК - 0.5, НУК - 0.5, ки-нетина - 0.2, сахарозы - до 2.5% и 0.8% агара.
Для выделения внутриклеточных растворимых белков 1 г каллусной ткани растирали при 4°С в 2 мл Трис-HCl-буфера (рН 7.4), содержавшего (мМ): Трис - 50, сахарозу - 300, KCl - 5, ЭДТА - 5, аскорбиновую кислоту - 25, ДТТ - 10, ФМСФ - 1 и пепстатин А - 1. Полученный гомогенат фильтровали через несколько слоев Miracloth и центрифугировали при 12000 g в течение 30 мин при 4°С. Белки из супернатанта осаждали добавлением ацетона до конечной концентрации 80%.
Образовавшийся осадок собирали центрифугированием (12000 g, 10 мин), промывали 3 раза холодным 80% ацетоном и высушивали в струе воздуха при комнатной температуре до полного испарения ацетона. Количество белка измеряли, согласно методу Bradford [20], используя БСА в качестве стандарта. Для проведения изоэлектри-ческого фокусирования 300 мкг белка растворяли в 220 мкл буфера для изоэлектрофокусирования (ИЭФ-буфер: 8 М мочевина, 2 М тиомочевина, 2% 3 - [(холаминопропил) -диметиламмоний] -1 -пропансульфонат (CHAPS), 0.2% амфолит
(рН 3-10), 3 мМ ДТТ и 20 мМ Трис-буфер). Полоски геля (стрипы, производства "Вю-Rad" длиной 17 см) регидратировали с образцами при 20°С 12 ч в ИЭФ-буфере с иммобилизованным градиентом рН (рН 3-10). Изоэлектрическое фокусирование образца проводили с использованием прибора Protean IEF Cell Bio-Rad ("Bfo-Rad", США) при 20°С в следующем режиме: 15 мин при напряжении 250 В, затем напряжение линейно повышали до 4000 В в течение 2 ч, далее проводили изоэлектрическое фокусирование образца при том же напряжении в течение 2 ч. Общее количество вольт-часов составило 60000, при 20°С, с силой тока 50 мкА на стрип. Затем стрипы по 15 мин выдерживали в уравновешивающем буфере 1 (6 М мочевина, 2% ДДС, 30% глицерин, 50 мМ Трис-HCl (pH 8.8), следы бромфенолово-го синего и 2% ДТТ) и уравновешивающем буфере 2 (6 М мочевина, 2% ДДС, 30% глицерин, 50 мМ Трис-HCl (pH 8.8), следы бромфенолово-го синего и 2.5% йодацетамид). Оба конца стрипа (по 0.5 см) отрезали, а оставшуюся часть стрипа накладывали на 6-16% полиакриламидный гель толщиной 1 мм. Электрофорез проводили с использованием электродного буфера, содержавшего 25 мМ Трис-HCl, pH 8.3, 192 мМ глицин и 0.1% ДДС, при силе тока 5 мА на гель в течение 30 мин, затем при 10 мА в течение 6-7 ч. После электрофореза гели фиксировали в 20% этаноле и 10% уксусной кислоте в течение 1 ч. Далее отмытые бидистиллированной водой гели инкубировали 2 мин в 0.03% растворе Na2S2O3, а затем 15 мин в 0.1% водном растворе азотнокислого серебра с 0.037% формальдегидом. Затем гели ополаскивали дважды бидистиллированной водой и инкубировали в проявляющем растворе (4% Na2CO3 и 0.037% формальдегид) до появления четко различимых пятен. Реакцию останавливали в 10% уксусной кислоте. Затем гели окрашивали 2% раствором Кумасси голубого R-250. Окрашенные гели сканировали с помощью сканера Epson Perfection 4500 Photo. Полученные изображения обрабатывали с использованием программного пакета PediQuest 3.0. Для идентификации белков методом фингерпринтинга пептидных масс необходимые пятна вырезали и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.