научная статья по теме ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ ГИПОТАЛАМУСА У ЗИМОСПЯЩИХ СУСЛИКОВ CITELLUS PYGMAEUS PALLAS В УСЛОВИЯХ ГИБЕРНАЦИИ Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ ГИПОТАЛАМУСА У ЗИМОСПЯЩИХ СУСЛИКОВ CITELLUS PYGMAEUS PALLAS В УСЛОВИЯХ ГИБЕРНАЦИИ»

НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 3, с. 218-224

УДК 591.481.1+612.822.1+591.543.42

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ ГИПОТАЛАМУСА У ЗИМОСПЯЩИХ СУСЛИКОВ Citellus pygmaeus Pallas В УСЛОВИЯХ ГИБЕРНАЦИИ

© 2014 г. Э. З. Эмирбеков, М. Э. Пашаева*

Дагестанский филиал ФГАОУВПО "Южный федеральный университет" в г. Махачкале

В данном исследовании представлены результаты протеомного анализа ткани гипоталамуса суслика Citellus pygmaeus Pallas во время глубокой гибернации. Описаны изменения отдельных белков, в том числе белков цитоскелета (Таи(р$ег199/202)-протеина, цитокератинов 8, 13 и 19, альфа-тубули-на) и связанных с его функциями белков (S100, катепсин D). Повышение экспрессии цитокератинов, Таи(р$ег199/202)-протеина и катепсина D на фоне снижения экспрессии альфа-тубулина в гипоталамусе гибернирующих сусликов характеризует развитие процессов, направленных на снижение специализации нейрональных клеток мозга, разборки микроканальцев, участвующих в Са2+-транспорте, а также повышения экспрессии белков, характерных для эмбриональной нервной ткани во время глубокой спячки.

Ключевые слова: суслики, гибернация, гипоталамус, экспрессия белков, цитоскелет, зимняя спячка.

DOI: 10.7868/S1027813314020034

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время сформировалось представление о механизмах изменения функционального состояния мозга при гибернации. Установлены терморегуляторные центры мозга, основные ней-ромедиаторные системы, участвующие в процессе гибернации, а также метаболические параметры, изменяющиеся в динамике вхождения в спячку [2].

Во время гибернации происходит изменение метаболических процессов в нервных клетках. Особую роль в функционировании мозга в процессе гибернации играет цитоскелет, изменения структуры которого предопределяют низкую нейронную деятельность и характеризуют простую форму нейронной пластичности. Так показано, что у лягушек во время зимней спячки в волокнах мозжечка и в зрительном тракте уменьшается им-мунореактивность для фосфорилированного белка нейрофиламента (200 кЭа) и связанного с микроканальцами белка 2. Тогда как в клетках Пуркинье мозжечка увеличивается иммунореак-тивность связанного с микроканальцами белка 2. Изменения компонентов цитоскелета происходят на фоне уменьшения иммунореактивности кальмодулина в цитоплазме нервных клеток мозжечка [1].

*Адресат для корреспонденции: 367013, Махачкала, ул. Юсупова, д. 51, тел.: 8 (928) 2208584, e-mail: maya2405@mail.ru.

Установлены динамические изменения морфологической структуры синаптического аппарата в мозге сусликов в разные периоды гибер-нации: в период глубокой спячки значительно снижается количество шипикового аппарата синапсов в гиппокампальных нейронах средней ассоциативной зоны, но в процессе пробуждения наблюдается их восстановление. Эти быстрые, обратимые и повторные изменения указывают на циклический процесс частичной денервации/ре-иннервации гиппокампальных нейронов мшистыми волокнами в ходе врожденного, стереотипного поведения зимоспящих животных [3].

При этом в отличие от нейродегенеративных состояний (болезни Альцгеймера, Паркинсона) пластические перестройки цитоскелета клеток мозга у зимоспящих животных происходят циклично и являются нормальным физиологическим процессом. В гибернационном цикле ведущую роль играют нейрохимические процессы, происходящие в гипоталамусе [2], активном центре терморегуляции [4]. В связи с этим изучение характера изменений экспрессии белков в гипоталамусе мозга при зимней спячке является актуальным для разработки терапевтических методов борьбы с нейродегенеративными заболеваниями.

Целью данной работы было исследование изменения экспрессии белков (преимущественно цитоскелета) клеток гипоталамуса у зимоспящих сусликов в условиях зимней спячки.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты на животных выполнены с соблюдением принципов Европейской конвенции

0 защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.). Все поставляемые животные сопровождались ветеринарным свидетельством, а также сертификатами качества и здоровья, предоставляемые питомником. Работа выполнена на 16 сусликах Citellus pygmaeus Pallas. Продолжительность карантина составила 14 сут. Сусликов содержали в виварии на естественном рационе и при естественном освещении. Работа вивария была организована в соответствии с "Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию вивариев", утвержденными Главным государственным санитарным врачом 06.04.1973 г. № 1045-73.

Проводили сравнительный анализ экспрессии белков в гипоталамусе сусликов в бодрствующем состоянии и в состоянии гибернации. После эвтаназии мозг сусликов выделяли при минусовой температуре и извлекали гипоталамус.

Для протеомного анализа ткани мозга сусликов в процессе гибернации использовали микрочипы Panorama Antibody Microarray — Cell Signaling Kit (Sigma, США), содержащие антитела для выявления более 200 белков, относящихся к различным функциональным системам клетки (внутриклеточная сигнализация, клеточный цикл, апоптоз, адгезия, цитоскелет и др.).

После изоляции кусочки тканей помещали в фосфатный буфер. Отмывку продолжали 1 ч при температуре около 0°С (на льду). Затем образцы замораживали и хранили при температуре —85°С. Образцы ткани гомогенизировали. Затем проводили дополнительную ультразвуковую гомогенизацию с помощью ультразвукового гомогенизатора Sonics Vibracell (Sonics and Materials Inc.) в буфере А на льду. Этот буфер представляет собой Extraction/Labeling Buffer фирмы Sigma-Aldrich (USA) в наборе реактивов Panorama Ab Microarray Cell Signaling (Sigma-Aldrich) и дополненный смесью ингибиторов протеаз и фосфатаз, необходимых для сохранения белков и их фосфорилирован-ных форм, а также нуклеазой бензоназа, которая разрушает нуклеиновые кислоты. Длительность ультразвукового воздействия 3 с, перерыв 10 с. Число циклов — 20. Общее время озвучивания —

1 мин. После гомогенизации образцы центрифугировали в течение 20 мин на центрифуге Eppendorf 5417 C/R при 10000 g и 4°С. Затем отбирали супернатант, содержащий цитоплазматические белки, а из осадка, содержащего обломки клеток и клеточные ядра, экстрагировали ядерные белки с помощью Extraction Buffer, входящего в состав набо-

ра реактивов NXTRACT - CelLytic™ NuCLEAR™ Extraction Kit (For mammalian tissue or cultured cells) (Sigma-Aldrich, USA). Для этого осадок ресуспен-дировали и инкубировали 30 мин с данным буфером. Затем его центрифугировали 10 мин при 20000 g и 4°С. Полученный супернатант, содержащий ядерные белки, смешивали с полученной ранее цитоплазматической фракцией в соотношении 1 : 1 и определяли концентрацию белка по методу Бредфорд. Затем все пробы разбавляли с помощью Dilution and Equilibration Buffer (компонент NXTRACT) так, чтобы в них было по 1 мг/мл белка.

Флуоресцентное мечение белков. Все образцы разделяли на две пробы по 200 мкл, которые инкубировали в течение 30 мин. при комнатной температуре в темноте с флуоресцентными красителями Су3 и Су5 (GE Healthcare, UK) в концентрации 1 мг/мл и, наоборот, с помощью Су5 и Су3 соответственно. Эти красители флуоресцируют в разных спектральных диапазонах: угаах = 532 и 635 нм, что позволяет различать пробы по их флуоресценции. После флуорохромирования не-связавшийся краситель удаляли с помощью поставляемых в наборе колонок SigmaSpin, которые центрифугировали 4 мин при 4000 об./мин. Затем с помощью реагента Бредфорд контролировали содержание общего белка в пробах. Для получения достаточно интенсивного сигнала отношение молярных концентраций краситель/белок должно превышать 2. Двойное мечение опытного и контрольного образцов флуорохромами Су3 и Су5 и, наоборот, Су5 и Су3, позволяет избежать проблем с перекрестной специфичностью антител и осуществить полный самоконтроль эксперимента.

Протеомные микрочипы. Наборы Panorama Ab Microarray Cell Signaling (Sigma-Aldrich) состоят из комплекта реактивов и двух одинаковых микрочипов — предметных стекол, покрытых нитро-целлюлозной мембраной, на которых в дубликате — по две микрокапли для каждого антитела — иммобилизованы 448 микрокапель с 224 антителами против белков, участвующих во внутриклеточной сигнальной регуляции. Микрокапли организованы в 4 х 4 блока по 14 капель (или пятен) для 7 антител в дубликате. Кроме них в правом нижнем углу каждого блока нанесены микрокапли с бычьим сывороточным альбумином (негативный контроль) и с альбумином, конъюгиро-ванным с флуорохромами Су3 и Су5 (позитивный контроль) [5].

Гибридизация. После флуорохромирования и опытный, и контрольный образцы, окрашенные Су3 и Су5 соответственно, добавлялись в одинаковых концентрациях (по 10 мкг/мл) в пробирку,

220

ЭМИРБЕКОВ, ПАШАЕВА

• ••• о о • •

• • о о • • о о

• • • •

© ® • • • *

• • • •

я в • •

в) 9 • •

О о •

©О •••• ••••

О® ft 0

• ••• 9 • • • • • I I

• • «sa • в » •

mi о о о О О в 01

• I »IQO • • ОО

® в • • Q в • < •

• • J J

® © I I «loo •••

О О О 9 О О • • • • в

& Q Ф О О .

• • « • •

Рис. 1. Пример протеомного микрочипа Panorama Ab Microarray Cell Signaling (Sigma-Aldrich).

содержащую 5 мл буфера Array Incubation Buffer (входящего в поставляемый набор реактивов). То же делали с противоположно мечеными образцами, окрашенными флуорохромами Су5 и СуЗ, соответственно. Для гибридизации микрочипы помещались в кюветы quadriPERM Cell Culture Vessel (компонент набора реактивов, поставляемого с данными микрочипами), содержащие 5 мл первой смеси, а другой — в такую же кювету, содержащую 5 мл второй смеси с противоположно окрашенными пробами. Кюветы защищали от света алюминиевой фольгой и инкубировали 40 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Затем микрочипы трижды промывали фосфатным буфером, содержащим TWEEN-20, и трижды — деионизованной водой по 5 мин в каждой среде при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере. После высушивания в течение ночи при комнатной температуре микрочипы были готовы к сканированию.

Сканирование образцов и анализ данных. Уровни экспрессии белков оценивали по интенсивности их флуоресценции в пятнах с иммобилизо

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Медицина и здравоохранение»