научная статья по теме ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРОВ СЕМЕЙСТВА TGF И ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ FGF2 В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА, ПОДДЕРЖИВАЕМЫХ В РАЗНЫХ СИСТЕМАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Биология

Текст научной статьи на тему «ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРОВ СЕМЕЙСТВА TGF И ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ FGF2 В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА, ПОДДЕРЖИВАЕМЫХ В РАЗНЫХ СИСТЕМАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ»

ОНТОГЕНЕЗ, 2013, том 44, № 1, с. 10-23

= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

УДК 611-013;57.086.835;577.218

ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРОВ СЕМЕЙСТВА TGFß И ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ FGF2 В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА, ПОДДЕРЖИВАЕМЫХ В РАЗНЫХ СИСТЕМАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

© 2013 г. Н. В. Лифанцева*, А. М. Кольцова**, Г. Г. Полянская**, О. Ф. Гордеева*

* Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26

E-mail: olgagordeeva@yandex.ru ** Институт цитологии РАН, 194064Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4 Поступила в редакцию 06.08.12 г.

Окончательный вариант получен 04.09.12 г.

Эмбриональные стволовые клетки мыши и человека находятся в разных статусах плюрипотентно-сти — базовом и первичном (naive/ground and primed states). Механизмы сигнальной регуляции клеток в базовом и первичном статусах плюрипотентности значительно различаются. Для того, чтобы понять вклад эндогенных и экзогенных факторов в поддержании метастабильного состояния клеток в разных статусах плюрипотентности, мы исследовали экспрессию факторов семейства TGFß (ActivinA, Nodal, Leftyl, TGFßl, GDF3 и BMP4) и FGF2, инициирующих соответствующие сигнальные пути, в эмбриональных стволовых клетках мыши и человека (мЭСК и чЭСК) и поддерживающих их фидерных клетках. Количественный ПЦР анализ генной экспрессии показал, что паттерны эндогенной экспрессии изучаемых факторов значительно различаются в мЭСК и чЭСК. Наиболее существенные различия были обнаружены в уровнях эндогенной экспрессии TGFß1, BMP4 и ActivinA, а также FGF2. Источниками экзогенных факторов ActivinA, TGFßl и FGF2 для чЭСК являются фидерные клетки (эмбриональные фибробласты мыши и человека), экспрессиру-ющие высокие уровни этих факторов, а также низкий уровень BMP4. Таким образом, наши данные показали, что поддержание метастабильного недифференцированного состояния плюрипотентных клеток in vitro достигается в мЭСК и чЭСК с помощью различных схем регуляций ActivinA/Nodal/ Lefty/Smad2/3 и BMP/Smadl/5/8 эндогенных ветвей TGFß сигналинга. Необходимость экзогенной стимуляции или ингибирования этих сигнальных путей обусловлена различиями в паттернах эндогенной экспрессии факторов семейства TGFß и FGF2 в мЭСК и чЭСК. Для чЭСК усиление ActivinA/ Nodal/Lefty/Smad2/3 сигналинга с помощью экзогенных факторов, возможно, является необходимым для ослабления эффектов BMP/Smadl/5/8 сигнальных путей, стимулирующих дифференци-ровку в клетки внезародышевых структур. Значительные различия эндогенной экспрессии FGF2 в клетках с базовым и первичным статусом плюрипотентности свидетельствуют о различной степени вовлеченности этого фактора в регуляцию самообновления плюрипотентных клеток.

Ключевые слова: эмбриональные стволовые клетки, плюрипотентность, базовый и первичный статусы, дифференцировка, сигнальные пути, TGFß, ActivinA, FGF.

DOI: 10.7868/S0475145013010060

Эмбриональные стволовые клетки мыши и человека являются in vitro моделями плюрипотентных клеток эмбрионов млекопитающих, находящихся в разных статусах плюрипотентности — базовом и первичном (naive/ground and primed states) (Nichols, Smith, 2009). При переходе от базового к первичному статусу плюрипотентные клетки эмбриона утрачивают способность к развитию в линию половых клеток (Hayashi, Surani, 2009; Guo et al., 2009; Han et al., 2010). Эмбриональные стволовые клетки мыши (мЭСК), поддерживаемые

in vitro в базовом статусе плюрипотентности, гомологичны клеткам внутренней клеточной массы бластоцисты, т.к. способны к развитию во все типы соматических и половых клеток после инъекции их в бластоцисту. Однако эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК), также полученные из бластоцист человека, отличаются от мЭСК системой поддержания и скоростью их самообновления in vitro (Smith et al., 1988; Savatier et al., 1996; Thomson et al., 1998; Burdon et al., 2002; Daheron et al., 2004; Vallier et al., 2005; Xu et al., 2005;

Becker et al., 2006). Кроме того, обнаружено значительное сходство чЭСК с более поздней эмбриональной популяцией, культивируемой in vitro, — стволовыми клетками эпибласта мыши (epiblast stem cells, EpiSCs), которые находятся в первичном статусе плюрипотентности (Brons et al., 2007; Tesar et al., 2007; Vallier et al., 2009; Hanna et al., 2010; Гор-деева и др., 2011).

Для поддержания in vitro мЭСК и чЭСК в плю-рипотентном статусе используют разные системы культивирования, которые можно рассматривать как искусственные клеточные ниши, обеспечивающие оптимальное микроокружение для самообновления плюрипотентных клеток. ЭСК человека и мыши способны расти на фидерных клетках, полученных из фибробластов различного происхождения, а также в бесфидерных системах, включающих различные компоненты внеклеточного мат-рикса и определенные наборы факторов роста (Smith et al., 1988; Xu et al., 2001; Stojkovic et al., 2005; Vallier et al., 2005; Yoo et al., 2005; Eiselleova et al., 2008; Evseenko et al., 2009; Montes et al., 2009; Кольцова и др., 2011; Кольцова и др., 2012). Однако для самообновления мЭСК и чЭСК in vitro необходимы разные наборы факторов роста, что свидетельствует о различных механизмах сигнальной регуляции базового и первичного плюрипотентно-го статуса и ранних стадий детерминации эмбриональных популяций. Сигнальные пути факторов семейства TGFP и FGF2 являются одними из ключевых регуляторов поддержания плюрипотентно-го статуса и дифференцировки ЭСК in vivo и in vitro (Mummery, 2001; Valdimarsdottir, Mummery, 2005; Dreesen, Brivanlou, 2007; Pucéat, 2007; Lanner, Rossant, 2010), однако функциональные роли этих сигнальных путей в клетках с базовым и первичным статусом плюрипотентности остаются неясными.

Моделирование ранних стадий развития млекопитающих in vitro с использованием линий мЭСК и чЭСК позволяет исследовать механизмы функционирования сигнальных путей в развитии плюрипотентных клеток млекопитающих и их специализацию в различные типы клеток. Для того, что исследовать механизмы сигнальной регуляции клеток в разных статусах плюрипотентности, мы проводили анализ экспрессии факторов семейства TGFP и FGF2/bFGF, инициирующих соответствующие сигнальные пути, которые активно функционируют в мЭСК, чЭСК и поддерживающих их фидерных клетках. На основе данных сравнительного анализа экспрессии факторов семейства TGFP и FGF2 в мЭСК и чЭСК предложена гипотеза о функциональной роли сигнальных путей, активируемых этими факторами, при переходе плюрипотентных клеток от базового к первич-

ному статусу, а также к ранним стадиям дифферен-цировки эмбриональных популяций клеток.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Культивирование клеток in vitro. В работе была использована линия мЭСК R1, любезно предоставленная доктором А. Макларен (А. McLaren, WTCR Institute of Cancer and Developmental Biology, Cambridge, UK). Линия чЭСК ESM02 была любезно предоставлена проф. Г.П. Георгиевым (Институт биологии гена РАН, Москва). Линия чЭСК SC5 и линия эмбриональных фибробластов человека (чЭФ) были получены и охарактеризованы ранее в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург (Кольцова и др., 2011, 2012).

ЭСК мыши и человека культивировали в среде DMEM, содержащей 1мМ L-глутамина, 0.1 мМ заменимых аминокислот ("HyClone", США), 0.1 мМ ß-меркаптоэтанола ("Sigma", США) и 15% заменителя телячьей фетальной сыворотки (Knockout Serum Replacement, "Gibco", США). Недифференцированные мЭСК поддерживали на фидере из эмбриональных фибробластов мыши (мЭФ, полученных из E12.5 эмбрионов мышей C57Bl/6), инактивированных митомицином С (10 мкг/мл, "Sigma") или в бесфидерной системе в среде, содержащей фактор ингибирования лейкемии (leukemia inhibitory factor, LIF, 10 нг/мл, "Sigma"). Недифференцированные чЭСК линии ESM02 поддерживали на инактивированном фидере мЭФ, а чЭСК SC5 — на фидере из чЭФ. В среду для культивирования чЭСК добавляли рекомбинант-ный фактор роста фибробластов человека (FGF2/bFGF, 10 нг/мл, "Invitrogen", США).

Для рутинного культивирования мЭФ и чЭФ использовали среду DMEM, содержащую 1 мМ L-глутамина ("HyClone", США) и 10% телячьей фетальной сыворотки ("HyClone", США). Для анализа генной экспрессии в фидерных клетках их культивировали в среде для культивирования ЭСК мыши и человека в течение 24 ч.

Фидерные клетки мЭФ и чЭФ, а также мЭСК пассировали с использованием раствора трипсина (0.05% Trypsin-EDTA solution, "HyClone"). Для пассирования чЭСК использовали метод механического разделения колоний недифференцированных клеток на кластеры.

Эмбриоидные тела (ЭТ), формируемые при дифференцировке мЭСК, получали с помощью метода "висячей капли", описанного ранее (Горде-ева и др., 2009). ЭТ ESM02 и SC5 получали при механическом разделении колоний недифференцированных чЭСК и последующем культивировании клеточных кластеров в планшетах для суспензион-

Таблица 1. Структура праймеров, используемых для анализа генной экспрессии в эмбриональных стволовых клетках и эмбриональных фибробластах мыши

Ген № Последовательности Прямой и обратный праймеры Размер, п.о.

Oct4/Pou5f1 NM_013633.2 5'caccctgggcgttctctttg3' 5'gttctcattgttgtcggcttcc3' 142

Nanog NM_028016 5'aactctcctccattctgaacctga3' 5'ggtgctgagcccttctgaatc3' 136

Gata4 NM_008092 5'tctcactatgggcacagcag3' 5'gggacagcttcagagcagac3' 100

ActivinA NM_002192 5'tggagcagacctcggagatcatcac3' 5'ttggtcctggttctgttagccttgg3' 160

Nodal NM_013611 5'gcgagtgtcctaaccctgtg3' 5'atgctcagtggcttggtc3' 136

Lefty1 NM_010094 5 'tgtgtgctctttgcttcctctg3' 5'gcagtgaacaatatgaaggacagag3' 123

Tgfb1 NM_011577 5'caattcctggcgttaccttgg3' 5'ccctgtattccgtctccttgg3' 120

Bmp4 NM_007554 5'tctggtctccgtccctgatg3' 5'cgctccgaatggcactacg3' 175

Gdf3 NM_008108 5'gatgagtgtgggtgtgggtag3' 5'gtccgattcaagagagcataagc3' 109

Fgf2 NM_008006 5'cgtcaaactacaactccaagcag3' 5'tccagtcgttcaaagaagaaacac3' 147

Hprt NM_013556 5'cgttgggcttacctcactgctttc3' 5'ggtcataacctggttcatcatcgctaatc3' 150

ного культивирования ("Greinerbio", Германия) в течение последующих 5 сут (ЭТ).

Анализ генной экспрессии. Анализ генной экспрессии проводили в клетках и ЭТ, растущих в бессывороточной среде: фидерных клетках мЭФ и чЭФ, в мЭСК, растущих в среде с LIF, в

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»