ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2008, том 55, № 1, с. 83-88
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА А6-ДЕСАТУРАЗЫ Mucor circinelloides ПРИВОДИТ К НАКОПЛЕНИЮ у-ЛИНОЛЕНОВОЙ КИСЛОТЫ В ТРАНСГЕННЫХ
РАСТЕНИЯХ ТАБАКА
© 2008 г. И. Л. Хао, К. X. Мэй, Ф. Чжао, С. Ин, P. X. Ли, И. Б. Ло
Факультет питания и пищевой промышленности Китайского сельскохозяйственного университета, Пекин,
Китай
Поступила в редакцию 11.09.2006 г.
Гамма-линоленовая кислота (ГЛК; C18:3 А6,9,12) - ЖК, играющая важную роль в биологических структурах и функциях клетки и применяемая для производства пищевых добавок. Она не содержится в масличных культурах, хотя во многих из них в значительных количествах содержится ли-нолевая кислота, которая в присутствии фермента А6-десатуразы может быть преобразована в ГЛК. Для получения ГЛК в семенах масличных культур мы выделили кДНК, кодирующую А6-де-сатуразу ЖК нитчатого гриба Mucor circinelloides M29. Экспрессия данного гена в трансгенных растениях табака привела к накоплению ГЛК в количестве 23.1% от суммарного содержания ЖК. Полученный нами результат дает основания считать, что введение гена А6-десатуразы M. circinelloides в геном коммерческих масличных культур позволит наладить крупномасштабное производство ГЛК, применяемой в производстве пищевых добавок и фармацевтической промышленности.
Ключевые слова: Nicotiana tabacum - Mucor circinelloides - Аб-десатураза - у-линоленовая кислота -GUS-окрашивание.
ВВЕДЕНИЕ
Гамма-линоленовая кислота (ГЛК) - ЖК, играющая важную роль в питании человека и животных. Она играет ключевую роль в биологических и клеточных процессах и, по некоторым данным, может успешно применяться для лечения мастал-гии, атопической экземы, рака и диабетической невропатии [1]. У животных синтез ГЛК из незаменимой линолевой кислоты (С18:2 А9,12) катализируется Аб-десатуразой. Это превращение является стадией, лимитирующей скорость образования полиненасыщенных ЖК с длинной цепью. Есть данные, что многие физиологические и патологические процессы, такие как старение, стресс, диабет и экзема, а также некоторые инфекции снижают активность этого фермента и приводят к дефициту ГЛК в организме [2]. Этому можно препятствовать путем введения в рацион питания дополнительного количества ГЛК [1]. Масла, содержащие ГЛК, широко используются как составные компоненты специальных пищевых и фармацевтических добавок. Поэтому существует повышенный интерес к крупномасштабному производству
Сокращения: ГЛК - у-линоленовая кислота; ПЦР - поли-меразная цепная реакция; GUS - ß-глюкуронидаза. Адрес для корреспонденции: Y.L. Hao. Department of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, P.O. Box 398, Beijing, 100083 China. Fax: +86 01062736479; e-mail: lyb@cau.edu.cn
масличных сельскохозяйственных культур, которые содержали бы ГЛК [3].
В естественных условиях ГЛК в семенах масличных культур не образуется. Однако во многих из них в значительном количестве образуется ли-нолевая кислота, которая может быть превращена в ГЛК ферментом Аб-десатуразой, если он в них присутствует. Для того, чтобы добиться образования ГЛК в семенах масличных культур, мы выделили кДНК, кодирующую Аб-десатуразу нитчатого гриба Мисог circinelloid.es М29. Экспрессия соответствующего гена в растениях трансгенного табака позволила добиться содержания ГЛК на уровне 23.1% от суммарного содержания ЖК. Полученные нами результаты показывают, что введение гена Аб-десатуразы М. circinelloides в сельскохозяйственные масличные культуры позволит наладить экономически выгодное производство ГЛК в больших количествах для нужд пищевой и фармацевтической промышленности.
Десатурация ЖК, т.е. введение двойных связей в их ацильные цепи, осуществляется при помощи десатураз. У растений существует две группы деса-тураз: растворимые пластидные десатуразы, использующие в качестве субстратов тиоэфиры, прикрепленные к ацил-переносящему белку, и мембраносвязанные десатуразы, субстратом которых являются ЖК, этерифицированные до сложных липидов (например, фосфатидилхолина).
83
6*
Каждая из этих групп характеризуется своей кон-сенсусной последовательностью в структуре белка и своей электрон-донорной системой, с помощью которой и происходит десатурация [4, 5]. На основе данных о консенсусных последовательностях были выделены новые гены, кодирующие десату-разы ряда видов растений. В частности, предпринимался ряд попыток изменить ферментативный путь десатурации C18 ЖК и направить его в сторону образования ГЛК [6-10].
M. circinelloides - нитчатый гриб с большим относительным содержанием ГЛК (28.9 г/100 г всех ЖК); однако суммарное содержание масел в нем составляет лишь 14.5 г/100 г биомассы. Ранее мы клонировали Д6-десатуразу данного штамма гриба и встроили его в геном Saccharomyces cerevisiae. В результате получили, что образование ГЛК в генетически модифицированных дрожжах достигало 50% от суммарного количества ЖК, и это свидетельствует о том, что Д6-десатураза M. circinelloides действительно позволяет добиться высокого уровня преобразования линолевой кислоты в ГЛК в организме [11].
Данных об успешной экспрессии гена Д6-деса-туразы M. circinelloides в семенах каких-либо масличных культур на сегодняшний день нет. Поэтому в данной работе мы встроили этот ген в геном табака, чтобы проверить, будет ли Д6-десатураза M. circinelloides функционировать в растении. Полученные нами результаты показали, что этот фермент действительно может превращать значительное количество ЖК со структурой C18:2 Д9,12 в ЖК 18:3 Д6,9,12. Поэтому ген Д6-десатуразы M. circinelloides может рассматриваться как потенциальный инструмент генетической модификации масличных культур для крупномасштабного производства ГЛК для пищевой и фармацевтической промышленности.
МЕТОДИКА
Растительный материал, штаммы бактерий и условия выращивания. Работу проводили с растениями табака (Nicotiana tabacum L., сорт Sanshengy-an). Для трансформации использовали листовые диски стерильных растений, выращенных на свету при 22°C на среде MC с добавлением 2% сахарозы [12]. Для клонирования и размножения плазмид использовали штамм DH5a Escherichia coli. Для трансформации растений использовали штамм Agrobacterium EHA105. Agrobacterium выращивали в среде LB при 28°C с антибиотиками. Гриб Mucor circinelloides хранили на картофельно-декстрозной среде PDM ("Life Tech", США) при 4°C. Для опытов нарезали квадратики размером 1-2 см, инокулиро-вали их в жидкую среду PDM и выращивали гриб на качалке при 28°C и 200 об./мин. Через 48 ч собирали мицелий для выделения РНК. Все операции с ДНК проводили по стандартным методикам [13].
Выделение РНК и синтез кДНК. Суммарную РНК выделяли из 500 мг свежего мицелия гуани-дин-тиоционатным методом, как описано в [14], и используя 1 мкг суммарной РНК, синтезировали одноцепочечную кДНК с помощью набора для обратной транскрипции ("Promega", США) в соответствии с инструкцией производителя. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфичными праймерами.
Клонирование кДНК Аб-десатуразы M. circinelloides методом ПЦР. В соответствии с последовательностью ДНК (номер доступа в Генбанке AB052086) и при помощи программы Primer 5 разработали специфические праймеры, удлиненные на 5'-конце сайтами рестрикции XbaI и SacI для облегчения последующего клонирования продуктов ПЦР. Прямой праймер имел последовательность 5'-CGTCTAGAATGAGCAGCGACGTAG-3' (отжигается к инициирующему метионину в месте, указанном жирным шрифтом), а обратный 5'-TGC-GAGCTCTTAGAGCATTTTTTTGCTGAATT-3' (отжигается к последовательности, комплементарной стоп-кодону, указанному жирным шрифтом). Данные праймеры мы использовали для амплификации продуктов обратной транскрипции кДНК деса-туразы. После начальной денатурации при 94°C в течение 5 мин следовало 30 циклов реакции: 94°C в течение 1 мин, 60°C в течение 30 с и 90°C в течение 90 с, и в заключение препараты выдерживали при 72°C в течение 10 мин. Продукты реакции разделяли в 1%-ном агарозном геле, из которого вырезали полосы ДНК для ее очистки. Очищенный ПЦР-продукт обрабатывали ферментами XbaI и SacI и лигировали его в фагмидный вектор pBK-CMV для получения рекомбинантной плазмиды pdes6. Для секвенирования плазмидную ДНК очищали при помощи набора QIAprep ("Qiagen", США). Расшифровку нуклеотидных последовательностей проводили на секвенаторе Perkin Elmer ABl-377, используя набор реактивов Bigdye Terminator, а для анализа последовательностей использовали программное обеспечение DNAMAN.
Построение вектора для экспрессии в растении и трансформация табака. Для выбора наиболее подходящих трансгенных растений вектор pBI121, обработанный ферментами HindIII и EcoRI, лигировали с вектором pCAMBIA1301 для получения рекомбинантной плазмиды pCAM1301+121. Полученная плазмида pCAM1301+121 имела три сайта экспрессии. Первый сайт предназначался для экспрессии интересующего нас гена, второй - для экспрессии гена устойчивости к гигромицину B, необходимого для отбора первичных трансформантов, а третий сайт содержал ген Р-глюкуронидазы (GUS), маркера трансгенных растений. Плазмиду pdes6 обработали ферментами XbaI и SacI, в результате чего получили фрагмент длиной около 1.4 т.п.н., содержавший открытую рамку считыва-
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА А6-ДЕСАТУРАЗЫ Mucor circinelloides
85
ния гена А6-десатуразы ЖК M. circinelloides. Продукты рестрикции XbaI и SacI очищали в геле и клонировали в pCAM1301+121 для получения плазмиды pCAM1301+121des6, которую встраивали в штамм Agrobacterium tumefaciens EHA105 методом электропорации. Растения табака трансформировали методом "листовых дисков" [15]. Отбор первичных трансформантов проводили после обработки 20 мкг/мл гигромицином B. Растения содержали в виде стерильной культуры в контролируемых условиях.
Гистологическое окрашивание. Гистологическое исследование активности GUS осуществляли по методу Jefferson с соавт. [16], используя в качестве субстрата 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-Р^-глюкуроно-вую кислоту (X-Gluc). Перед просмотром листья не-трансформированных и гигромицин-устойчивых растений табака отмывали от
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.