МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, том 47, № 6, с. 1028-1030
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.214:577.215:575.852
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА F3h В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНАХ ПШЕНИЦЫ
© 2013 г. О. Ю. Шоева*, Е. К. Хлесткина
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090
Поступила в редакцию 20.03.2013 Принята к печати 19.05.2013
Ген F3h кодирует у растений один из ключевых ферментов биосинтеза флавоноидных соединений — флаванон-3-гидроксилазу. У большинства видов имеется одна копия этого гена, тогда как в геноме мягкой пшеницы (ТгШсит aestivum Ь., 2п = 6х = 42, геном ББААББ) найдено четыре копии. При изучении транскрипции копий гена F3h в различных органах у разных генотипов пшеницы методом ОТ-ПЦР показано, что три гомеологичных гена (ГЗ^АТ, F3h-B1, F3h-DT) имеют сходные паттерны экспрессии и специфично транскрибируются только в окрашенных антоцианами перикарпе зерновки, стебле, колеоптиле и листе, а паралогичная копия F3h-B2 в геноме В — только в корнях пшеницы, где она, вероятно, участвует в биосинтезе бесцветных флавоноидных соединений, не связанных с биосинтезом антоцианов.
Ключевые слова: ген F3h, экспрессия, дупликация генов, функциональная специализация генов, флава-нон-3-гидроксилаза, биосинтез флавоноидов, ТгМсит aestivum Ь.
EXPRESSION OF THE F3h GENE IN VARIOUS WHEAT ORGANS, O. Y. Shoeva*, E. K. Khlestkina (Institute of Cytology and Genetics, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, 630090 Russia; *e-mail: olesya_ter@bionet.nsc.ru). In plants, the F3h gene encodes a key enzyme of flavonoid biosynthesis pathway, flavanone 3-hydroxylase. In most plant species, F3h is a single-copy gene, whereas in the genome of bread wheat (Triticum aestivum L., 2n = 6x = 42, BBAADD), four copies of this gene were found. Using RT-PCR, transcription of these copies was studied in various organs of several wheat genotypes. Three homoeologous copies (F3h-A1, F3h-B1, F3h-D1) manifested similar expression patterns and were specifically transcribed in caryopsis pericarp, culm, coleoptile and leaf colored with anthocyanins. The paralogous copy F3h-B2 in the B-genome was expressed only in wheat roots and probably is involved in biosynthesis of some uncolored flavonoid compounds unrelated to anthocyanin biosynthesis.
Keywords: F3h gene, gene duplication, functional specialization, flavanone 3-hydroxylase, flavonoid biosynthesis, Triticum aestivum L.
DOI: 10.7868/S0026898413060141
Флавоноидные соединения — постоянные компоненты растительных тканей. Они участвуют в процессах дыхания и онтогенеза, играют важную роль в окислительно-восстановительных и защитных реакциях, влияют на проницаемость мембран, являются субстратами ряда ферментов [1].
Огромное разнообразие флавоноидов (свыше 6500 соединений) возникает при участии более двадцати ферментов, которые на первом этапе синтезируют халконы, а затем дают начало различным классам флавоноидных соединений и их различным представителям внутри каждого класса [2]. Один из ключевых ферментов биосинтеза флавоноидов — флаванон-3-гидроксилаза (F3H; К.Ф. 1.14.11.9), которая, катализируя превращение флаванонов в дигидрофлавонолы, участвует в
* e-mail: olesya_ter@bionet.nsc.ru
биосинтезе пяти из двенадцати основных классов флавоноидных соединений [2, 3].
В геноме большинства видов растений имеется одна копия гена, кодирующего флаванон-3-гид-роксилазу [4]. Однако на ранних стадиях эволюции злаковых растений у общего предка трибы Triticeae возник паралог гена F3h, который затем у большинства видов данной группы подвергся псевдогенизации. До настоящего времени паралог гена F3h сохранился у ржи посевной (Secale cereale L., 2n = 2x = 14, геном RR), в геномах B и G полиплоидных видов пшеницы и у предка геномов B и G эгилопса спельтоидовидного (Aegilops speltoides Tausch., 2n = 2x = 14, SS) [4]. Таким образом, в аллогексаплоидном геноме пшеницы мягкой (Triticum aestivum L., 2n = 6x = 42, BBAADD) имеются четыре копии гена F3h [5]: три гомеолога
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ¥3к В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНАХ ПШЕНИЦЫ
1029
Перикарп Стебель Лист Колеоптиле Корень 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
¥3к-Л1 ¥3к-Б1 ¥3к-Б1
¥3к-Б2 иЬс
ОТ-ПЦР с использованием праймеров к генам ¥3к-Л1, ¥3к-Б1, ¥3к-Б1, ¥3к-Б2 и иЬс РНК, выделенной из различных органов пшеницы. 1 — линия Саратовская 29; 2 — линия 1: 829Рр1Рр2рр; 3 — линия829Рр1Рр3 .
(ортолога) в геномах А, В и Э (¥3к-Л1, ¥3к-Б1, ¥3к-Б1) и один паралог (¥3к-Б2) в геноме В. Последний локализуется на расстоянии около 40 сМ от гена ¥3к-Б1 [6] и, вероятно, является результатом дупликации небольшого сегмента хромосомы 2В [4].
Поддержание в эволюции дуплицированных копий одного и того же гена может быть связано с их функциональной специализацией. Для того, чтобы понять имеет ли место такая специализация копий гена ¥3к пшеницы и каковы различия между дуплицированными генами, в настоящей работе исследовали особенности транскрипции четырех копий гена ¥3к в различных органах пшеницы у генотипов, отличающихся содержанием флавоноидных пигментов антоцианов.
Изучали транскрипцию генов ¥3к у трех генотипов пшеницы: у сорта Саратовская 29 (С29), имеющего неокрашенный перикарп и слабую ан-тоциановую окраску стебля, колеоптиле и листьев, а также у почти изогенных линий данного сорта (к829Рр1Рр2рр и к829Рр1Рр3р [7]), которые отличаются от С29 по интенсивной антоциано-вой пигментации колеоптиля, стебля и перикар-па, а также по более высокому, по сравнению с С29, содержанию антоцианов в листьях. Условия выращивания растений, выделение суммарной РНК и синтез кДНК описаны ранее [8]. Образцы РНК из пшеницы трех генотипов выделяли одновременно из вегетативных органов и перикарпа в момент появления пигментации соответствующего органа, а из корней — на пятый день после прорастания зерновки. Для ПЦР на основе препаратов кДНК (в двух повторностях) использовали праймеры к генам ¥3к-Л1, ¥3к-Б1, ¥3к-Б1 и ¥3к-Б2 [5]. Эндогенным контролем служил ген иЬс [9]. Соответствие транскрибируемых фрагментов различным копиям гена ¥3к (DQ233636, ЕР463100, Еи402957, ЕШ02958) подтверждали путем секвенирования полученных ПЦР-продук-тов [4].
На рисунке показан результат ОТ-ПЦР с использованием праймеров для каждой из индивидуальных копий гена ¥3к. Гомеологичные гены ¥3к-Л1, ¥3к-Б1 и ¥3к-Б1 транскрибировались во всех окрашенных антоцианами органах, но не в корнях, антоцианов не содержащих. При этом каждая из копий транскрибируется более активно в интенсивно окрашенных линиях (1:829Рр1Рр2рр и 1:829Рр1Рр3р) по сравнению со слабо окрашенной С29, за исключением листьев, по которым С29 и к829Рр1Рр2рр не различаются (рисунок). Напротив, паралогичная копия ¥3к-Б2 транскрибируется в корнях, но не в перикарпе, стебле, листьях и колеоптиле (рисунок). Таким образом, у пшеницы транскрипционная активность гомео-логичных генов ¥3к-1 связана с биосинтезом фла-воноидных пигментов антоцианов в различных органах растения, тогда как ген ¥3к-Б2 специфически экспрессируется в неокрашенных корнях. Ранее транскрипцию паралогичной копии ¥3к-2 наблюдали также в корнях ржи [4]. Кроме того, в базе данных экспрессирующихся последовательностей пшеницы [10] опубликованы нуклеотид-ные последовательности, которые соответствуют ¥3к-Б2.
Тот факт, что картина транскрипции гомеоло-гичных копий ¥3к-Л1, ¥3к-Б1 и ¥3к-Б1 сходна и отличается от картины транскрипции ¥3к-Б2, соответствует опубликованным данным о структуре промоторов этих генов [4, 11]. Нуклеотидные последовательности регуляторной области генов ¥3к-Л1, ¥3к-Б1 и ¥3к-Б1 очень сходны [11], тогда как промотор гена ¥3к-Б2 существенно от них отличается [4].
Представление о возможном участии ¥3к-1 и ¥3к-Б2 в разных путях биосинтеза флавоноидов согласуется с тем фактом, что имеются структурные отличия между предсказанными аминокислотными последовательностями ¥3Н-1 и ¥3Н-Б2, а именно — по заменам в некоторых субстрат-специфичных сайтах [4]. Известно, что в разных путях биосинтеза флавоноидов на этапе превраще-
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ том 47 № 6 2013
1030
ШОЕВА, ХЛЕСТКИНА
ния флаванонов в дигидрофлавонолы используются разные субстраты (разные соединения из класса флаванонов) [12].
Возможно, ген F3h-2, специфически экспрес-сирующийся в корнях пшеницы и ржи, функционально отличается от генов F3h-1, однако его биологическое значение остается пока неясным.
Авторы выражают благодарность Генераловой Галине Владимировне (ИЦиТ СО РАН) за помощь в работе.
Исследование выполнено при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (12-04-33027_мол-а-вед), Президиума РАН (грант № 6.24 по программе "Молекулярная и клеточная биология") и гранта Президента Российской Федерации для молодых докторов наук (МД-2615.2013.4).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Peer W.A., Murphy A.S. 2006. Flavonoids as signal molecules. In: The Science of Flavonoids. Ed. E. Grotewold. N.Y: Springer Science+Business Media, pp. 239—268.
2. Winkel-Shirley B. 2001. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology and biotechnology. Plant Physiol. 126, 485-493.
3. Запрометов М.Н. 1974. Основы биохимии фенольных соединений. М.: Высшая школа.
4. Khlestkina E.K., Dobrovolskaya O.B., Leonova I.N., Salina E.A. 2013. Diversification of the duplicated F3h genes in Triticeae. J. Mol. Evol. 76, 261—266.
5. Khlestkina E.K., Röder M.S., Salina E.A. 2008. Relationship between homoeologous regulatory and structural genes in allopolyploid genome a case study in bread wheat. BMC Plant Biol. 8, 88.
6. Khlestkina E., Salina E., Matthies I., Leonova I., BörnerA., Röder M. 2011. Comparative molecular marker-based genetic mapping of flavanone 3-hydroxy-lase genes in wheat, rye and barley. Euphytica. 179, 333— 341.
7. Arbuzova YS., Maystrenko O.I., Popova O.M. 1998. Development of near-isogenic lines of the common wheat cultivar 'Saratovskaya 29'. Cereal Res. Commun. 26, 39-46.
8. Tereshchenko O.Y., Gordeeva E.I., Arbuzova V.S., Börner A., Khlestkina E.K. 2012. The D genome carries a gene determining purple grain colour in wheat. CerealRes. Commun. 40, 334-341.
9. Himi E., Nisar
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.