МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 2, с. 289-293
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.21
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ТРАНСПОРТЕРА ABCA1 В ЛИМФОЦИТАХ И МАКРОФАГАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ
АТЕРОСКЛЕРОЗОМ
© 2011 г. Е. П. Демина1*, В. В. Мирошникова1, Т. И. Родыгина1, П. С. Курьянов2, А. Г. Виноградов3, А. Д. Денисенко3, А. Л. Шварцман1
Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Российской академии наук,
Гатчина, Ленинградская обл., 188350 2Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, 197089 3Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук, Санкт-Петербург, 197376 Поступила в редакцию 01.03.2010 г. Принята к печати 04.05.2010 г.
Известно, что АТР-связывающий кассетный транспортер A1 (ABCA1) играет значительную роль в транспорте холестерина из периферических тканей. Однако его влияние на развитие атеросклероза остается практически неизученным. Методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени обнаружено снижение уровня мРНК АВСА1 в лейкоцитах больных атеросклерозом по сравнению c лейкоцитами контрольной группы (медиана 0.57 ± 0.28 и 0.93 ± 0.14 у больных и в контрольной группе соответственно, p = 0.02). Уровень мРНК АВСА1 в макрофагах больных атеросклерозом, напротив, был выше, чем в контрольной группе (медиана 1.32 ± 0.10 и 0.90 ± 0.14 у больных и в контрольной группе соответственно, p = 0.014). Мы предполагаем, что уровень экспрессии гена ABCA1 в лейкоцитах может влиять на развитие атеросклероза у человека.
Ключевые слова: атеросклероз, обратный транспорт холестерина, макрофаги, транспортер АВСА1.
ABCA1 GENE EXPRESSION IN PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES AND MACROPHAGES IN PATIENTS WITH ATHEROSCLEROSIS, by E. P. Demina1*, V. V. Miroshnikova1, T. I. Rodygina1, P. S. Kurianov2, A. G. Vinogradov3, A. D. Denisenko3, A. L. Schwarzman1 ^Petersburg Nuclear Physics Institute, Russian Academy of Sciences, Gatchina, Leningrad region, 188350 Russia; 2Pavlov State Medical University, Saint-Petersburg, 197089 Russia; 3Saint-Petersburg Institute of Experimental Medicine, Russian Academy of Medical Sciences, Saint-Petersburg, 197376 Russia; *e-mail: citritt@gmail.com). ABCA1 transporter is known to play important role in the cholesterol transport from peripheral tissues. However its contribution in atherosclerosis development remains not completely understood. Using Real Time PCR, a significant reduction of ABCA1 mRNA level in leukocytes of patients with atherosclerosis was determined when compared with controls. Mean ABCA1 expression levels in leukocytes for the group ofpatients and for the control group are 0.57 ± 0.28 and 0.93 ± 0.14 (p = 0.02). At the same time we detected a significant increase of ABCA1 mRNA level in macrophages of patients when compared with controls. Mean ABCA1 expression levels in macrophages for the group of patients and for the control group are 1.32 ± 0.10 and 0.90 ± 0.14 (p = 0.014). In summary, we suggest that expression level of ABCA1 gene may contribute to the development of atherosclerosis.
Keywords: atherosclerosis, reverse cholesterol transport, macrophage, ABCA1 transporter.
Во многих странах, в том числе и в России, заболевания сердечно-сосудистой системы, обусловленные атеросклерозом, занимают первое место среди причин, приводящих к смерти. По данным Министерства здравоохранения России смертность от заболеваний, вызванных атеросклерозом, составляет
Принятые сокращения: АВСА1 — АТР-связывающий кассетный транспортер А1; ЛПВП — липопротеины высокой плотности; ОТХ — обратный транспорт холестерина; ОХС — общий холестерин; Х-ЛПВП — холестерин в составе ЛПВП; М-С8Б —колониестимулирующий фактор макрофагов.
* Эл. почта: citritt@gmail.com.
более 50% от всех причин, приводящих к смерти. Существование обратной связи между концентрацией липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в плазме крови и развитием атеросклероза показано во многих работах [1, 2]. Предполагается, что ЛПВП участвуют в удалении холестерина из периферических тканей и его транспорте в печень. Этот антиатерогенный процесс известен как обратный транспорт холестерина (ОТХ) [3, 4]. Ключевой белок ОТХ—АТР-связывающий кассетный транспортер А1 (АВСА1), функция которого заключается в переносе холестерина и фосфолипидов из внутри-
290
ДЕМИНА и др.
клеточного матрикса на незрелые пре-бета-ЛПВП [5]. Таким образом, транспортер АВСА1 участвует в сборке и формировании частиц ЛПВП и может существенно влиять на развитие атеросклеротического процесса.
Понимание роли АВСА1 в развитии атеросклероза в значительной мере связано с заболеванием, получившим название "болезнь острова Танжер". Это редкое генетическое заболевание, обнаруженное на одном из американских островов, вызвано мутациями в экзонах гена ЛБСЛ1 и характеризуется практически полным отсутствием в крови ЛПВП, нарушением ОТХ, накоплением эфиров холестерина в содержащих макрофаги тканях [6—9]. При болезни острова Танжер наблюдается быстрое развитие атеросклероза, ишемическая болезнь сердца и высокая частота раннего инфаркта миокарда [9, 10]. Несмотря на известный молекулярный механизм болезни острова Танжер, вклад ЛБСЛ1 в развитие атеросклероза и сердечно-сосудистой патологии оказался не столь очевидным. Так, гетерозиготное носительство мутаций потери функции Р10658, G1216Y Ш800Н, И2144Хв генеЛБСЛ1, хотя и вызывало снижение уровня ЛПВП в плазме крови, но не ассоциировалось с повышенным риском ишемиче-ской болезни сердца [11]. В то же время, варианты гена ЛБСЛ1, содержащие замены нуклеотидов в ре-гуляторной области, ассоциированы с развитием атеросклероза независимо от уровня липидов в плазме крови [12]. Эти результаты впервые указали на то, что уровень экспрессии гена ЛБСЛ1 может быть независимым фактором, влияющим на развитие атеросклероза. Это предположение подтверждено в опытах на трансгенных животных, которые показали, что развитие экспериментального атеросклероза определяется тканеспецифической экспрессией гена ЛБСЛ1 [13, 14].
В совокупности опубликованные данные позволяют высказать гипотезу, согласно которой уровень экспрессии гена ЛБСЛ1 может быть независимым фактором риска развития атеросклероза у человека. Доказательству этой гипотезы посвящена настоящая работа, в которой впервые предпринята попытка определить ассоциацию между уровнем экспрессии гена ЛБСЛ1 в лейкоцитах и макрофагах и развитием атеросклероза у человека.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Проведение данной работы одобрено этическим комитетом Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П. Павлова.
Группа больных атеросклерозом и контрольная группа состояли из жителей Санкт-Петербурга, не связанных узами родства. Образцы венозной крови получены от 28 больных атеросклерозом, подтвержденным при ангиографическом исследовании. Ангиографическую диагностику атеросклероза проводили на кафедре факультетской хирургии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П. Павлова. Группа больных, у
которых анализировали экспрессию ABCA1 в лейкоцитах, состояла из 18 человек — 62% мужчин и 38% женщин (средний возраст 48.89 ± 5.30 лет). Группа больных, у которых анализировали экспрессию ABCA1 в макрофагах, состояла из 10 человек — 60% мужчин и 40% женщин (средний возраст 50.20 ± 7.60 лет). У каждого больного атеросклероти-ческие поражения находились как минимум в одной артерии одного из трех артериальных бассейнов — церебрального, коронарного, бассейна артерий нижних конечностей. Группа больных была гетерогенной по степени локального (% окклюзии артерии атерогенной бляшкой) и диффузного (общее количество артерий, пораженных атеросклерозом) атеросклероза. Однако у всех больных как минимум в одной артерии одного из трех артериальных бассейнов выявлен стеноз более 50%, диагностированы клинические проявления атеросклероза, зависящие от локализации пораженных артерий. У всех больных измеряли концентрацию общего холестерина (ОХС) и холестерина в составе ЛПВП (Х-ЛПВП) в плазме крови.
Больные, вошедшие в выборку для изучения экспрессии ABCA1 в клетках крови, не принимали ни статинов, ни каких-либо иных гиполипидемиче-ских средств. Общая контрольная группа состояла из восьми человек (62.5% мужчин и 37.5% женщин, средний возраст 49.88 ± 5.69 лет) без сердечно-сосудистых заболеваний в анамнезе. Для анализа экспрессии гена ABCA1 в лейкоцитах и макрофагах отбирали две группы, близкие по демографическим параметрам, без частичного перекрывания в обеих выборках. Вошедших в контрольную группу индивидов отбирали после дополнительной консультации врача-кардиолога с учетом сходства демографических характеристик с группой больных атеросклерозом.
Определение уровня экспрессии гена АВСА1 в лейкоцитах и в макрофагах. Лейкоциты выделяли из свежесобранной цельной крови методом градиентного центрифугирования [15]. Для получения макрофагов клетки инкубировали в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 2 ч, после чего прикрепившиеся к чашкам Петри моноциты инкубировали в течение еще 24 ч, но уже в присутствии колониестимулирую-щего фактора макрофагов (M-CSF), индуцирующего дифференцировку моноцитов в макрофаги [16].
Препараты суммарной клеточной РНК получали с помощью набора AquaPure RNA Isolation Kit ("BioRad"). Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора iScript cDNA Synthesis Kit ("Bio-Rad").
Целостность РНК оценивали методом электрофореза в агарозном геле в 2.2 M формальдегиде [17, 18]. Отношение пиков 28S и 18S рибосомных РНК на электрофореграммах вычисляли с помощью программы Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). РНК экстрагировали из 106 клеток каждого образца, растворяли в 25—30 мкл воды и хранили при —80°C. В одну реакцию обратной транскрипции брали 25%
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ТРАНСПОРТЕРА ABCA1 В ЛИМФОЦИТАХ И МАКРОФАГАХ
291
Рис. 1. Ангиограмма больного с субокклюзией передней межжелудочковой ветви левой коронарной артерии (99%). Стрелкой показан участок окклюзии.
препарата суммарной РНК, выделенного из каждого образца.
Уровень э
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.