ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 575.1:582.951.4
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ЦЕКРОПИНА Р1 ПОВЫШАЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ Camelina sativa (L.) К МИКРОБНЫМ ФИТОПАТОГЕНАМ
© 2013 г. Н. С. Захарченко, М. А. Каляева, Я. И. Бурьянов
Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Пущино 142290 e-mail: znata_2004@rambler.ru Поступила в редакцию 01.08.2012 г.
Получены трансгенные растения камелины (Camelina sativa (L.) Crantz) с искусственным геном антимикробного пептида цекропина Р1 (сесР1). Агробактериальная трансформация проведена с использованием бинарного вектора рОА482::сесР1 методом вакуумной инфильтрации цветочных почек. Присутствие гена сесР1 в геноме растений подтверждено методом ПЦР. Экспрессия гена сесР1 в трансгенных растениях показана вестерн-блот анализом и по антимикробной активности растительных экстрактов по отношению к бактериальному фитопатогену Erwinia carotovora. Растения поколения F0 и Fi имели нормальный фенотип и сохраняли способность образовывать при самоопылении жизнеспособные семена. сесР1-растения проявляют повышенную устойчивость к бактериальным и грибным фитопатогенам: Erwinia carotovora и Fusarium sporotrichioides. Установлена повышенная устойчивость цекропин Р1-экспрессирующих растений к солевому стрессу. Обсуждается возможность включения гена цекропина Р1 в общую защитную систему растений против биотических и абиотических стрессов.
DOI: 10.7868/S0016675813050147
Камелина (Camelina sativa (L.) Crantz) — масличное растение семейства Brassicaceae [1], известное также как рыжик посевной, ложный лен, немецкий кунжут. Растение использовалось в питании, в 19 веке культивировалось в Европе и в России пока не было вытеснено более высокопродуктивными сельскохозяйственными растениями, а оно само не выродилось в сорное растение. С развитием современных промышленных технологий к этому растению возродился заслуженный интерес из-за его питательной ценности и неприхотливости в выращивании. Семена камелины содержат более 40% масла, приравниваемого по качеству к маслу кунжута. Масло семян этих растений отличается уникальным составом жирных кислот, из которых 90% являются ненасыщенными. Ценность камелинового масла заключается в высоком содержании полиненасыщенных жирных кислот, причем доля ю-3 ненасыщенных жирных кислот составляет 35—40%. Масло Camelina sativa отличается также высоким содержанием жирорастворимых каротиноидов, значительно превышающим их количество в подсолнечном, соевом и других маслах, богато витамином Е, который является мощным антиокси-дантом (105 мг на 100 мл масла), что в 2.5 раза больше, чем в масле рапса, и в 7 раз больше, чем в масле льна [2—4]. В настоящее время развивается культивирование камелины в Северной Америке, Австралии и в северных районах Европы. Проводятся исследования, направленные на получение
трансгенных растений камелины как продуцентов ценных биотехнологических продуктов [5, 6]. Получены трансгенные растения Camelina sativa, устойчивые к гербицидам [7], с модифицированным составом жирных кислот [8], устойчивые к некоторым болезням [9]. В России камелина выращивается в основном как культура для поддержания севооборота под подсолнечником и зерновыми культурами. Для производства масла его выращивают в ограниченном количестве в Орловской, Волгоградской и Саратовской областях. Рыжиковое масло производится с 2000 г. компанией "Провансаль" как продукт диетического питания для больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Несмотря на свою общую устойчивость, камелина чувствительна к бактериальным и грибным фитопатогенам, вызывающим увядание (Fusarium), заболевания корневой гнили (Pythium), и к ложной мучнистой росе (Peronospora). Одним из методов повышения устойчивости растений к фитопатогенам может быть трансформация растений генами пептидных антибиотиков, обладающих широким спектром антибиотической и фун-гицидной активности [10].
Целью нашей работы было получение растений Camelina sativa, экспрессирующих искусственный ген антимикробного пептида цекропи-на Р1 для повышения устойчивости растений к микробным фитопатогенам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Объектами исследования служили растения камелины (Camelina sativa (L.) Crantz) отечественного сорта Омский, полученные из Сибирской опытной станции ВНИИМК. Семена стерилизовали 1.5 мин в 70%-ном этаноле, затем 2 мин в 20%-ном растворе гипохлорита натрия и промывали 3 раза по 10 мин в стерильной дистиллированной воде. Семена проращивали на безгормональной среде Мурасига—Скуга (МС) [11], содержащей 7 г/л агара, 30 г/л сахарозы (рН 5.8) и стандартный набор солей. Для исследования солеустойчивости растений в среду МС добавляли 250 мМ NaCl. Растения культивировали при температуре 22—24°C, 16-часовом дне и освещенности 2 клк. Укорененные растения переносили в теплицу.
Штаммы бактерий и условия их культивирования. Для генетической трансформации использовали клетки штамма Agrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90RK) [12], содержащие вектор pGA482 [13] с искусственным геном антибактериального пептида цекропина Р1 [14]. Ночную культуру бактерий выращивали в среде LB [15], разводили до оптической плотности 1.0 при 600 нм и добавляли поверхностно-активное вещество Silwet L-77 до 0.025% [16].
В работе использовали фитопатогенный бактериальный штамм Erwinia carotovora subsp. caro-tovora В15, полученный из Horticulture СеПхе (Канада), и штамм фитопатогенного гриба Fusar-ium sporotrichioides, полученный из Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур им. В.С. Пустовойта (г. Краснодар).
Трансформация камелины. Растения с незрелыми цветочными почками помещали в суспензию агробактерий и выдерживали в —0.8 атм вакууме в течение 5 мин. После этого растения перекладывали на горизонтальную поверхность с влажной фильтровальной бумагой, сверху растения укрывали также влажной фильтровальной бумагой и выдерживали сутки в темноте при комнатной температуре. Затем растения переносили в теплицу и выращивали до конца вегетации. Полученные семена стерилизовали и проращивали на среде МС, содержащей 50 мг/л канамицина.
ПЦР-анализ. Для ПЦР анализа ДНК выделяли из листьев 3-недельных растений [17]. Полученную растительную ДНК использовали в качестве матрицы в ПЦР анализах. Для этого были использованы праймеры для гена cec P1: 1) 5'-CGG-GATCCATGGGCTCTTG-3' и 2) 5'-CGAGATCT-CTACTTAGCGCGGC-3'. Реакционная смесь содержала 0.1 мкг растительной ДНК камелины в качестве матрицы, 10 мМ трис-HCl, pH 8.8 (при 25°С), 50 мМ KCl, 0.1% Тритон Х-100, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ смеси дНТФ (USB, США), по 50 пмолей каждого праймера и 2.5 ед. ДНК поли-
меразы Taq ("Promega", США). Реакцию проводили в объеме 25 мкл при следующих условиях: 94°С - 5 мин; 30 циклов: 94°С - 1 мин, 55°С - 30 с, 72°С — 30 с, затем 72°С — 7 мин на амплификаторе Gene Amp® PCR System 2400 ("Perkin Elmer", США). Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 6%-ном ПААГе в трис-боратном буфере.
Вестерн-блот анализ. Для определения экспрессии гена сесР1 в трансгенных растениях получали бесклеточные экстракты [18]. Электрофорез проводили в трициновой системе ДСН-ПААГ, белки переносили на нейлоновую мембрану PDVF (Amersham Pharmacia Biotech, Великобритания) [19]. Иммуноферментный анализ цекропина Р1 проводили с помощью полученных к этому искусственному пептиду кроличьих поликлональ-ных антител и антикроличьих иммуноглобулинов, коньюгированных с пероксидазой хрена. Искусственный цекропин Р1 был получен методом твердофазного синтеза. Проявку мембраны проводили с помощью хемилюминесцентной системы ECL ("Pierce", США).
Анализ антимикробной активности растительных экстрактов. Для определения влияния экстрактов трансгенных растений на рост клеток фи-топатогенных бактерий Erwinia carotovora использовали метод радиальной диффузии [20]. Для этого листья анализируемых растений растирали в керамической ступке с жидким азотом, затем добавляли экстракционный буфер (10% глицерина, 40 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 100 мМ NH4Cl, 4 мМ фенилметилсульфонилфторид, 10.0 мМ трис-HCl, pH 7.5; 3.0 мг/мл дитиотрейтола, 0.2 мг/мл лейпептина, 0.2 мг/мл ингибитора трипсина; 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) [21] и продолжали растирать до гомогенной суспензии. Полученный экстракт центрифугировали 20 мин при 10000 g и супернатант использовали для определения в нем антибиотической активности. Концентрацию общего белка определяли по методу Бред форд [22]. Экстракты, содержащие равное количество общего белка из листьев трансгенных и двух контрольных (нетрансфор-мированные и трансформированные пустым вектором) растений, вносили в лунки 5 мм диаметром и 10 мм глубиной, приготовленные в 1.5% LB-агаре с бактериями (108 клеток/мл). Агаровые блоки инкубировали 8 ч при 4°С для диффузии экстрактов в агар, затем блоки переносили на 25°С и через 2 сут замеряли стерильные зоны вокруг лунок. Каждый опыт проводили с одним листом среднего яруса растения в трех биологических повторностях. Количественную оценку содержания цекропина Р1 в экстрактах трансгенных растений проводили сравнением с контрольными экспериментами, где в качестве стандарта использовали известные концентрации синтетического цекропина Р1 ("Sigma").
Биотесты на изолированных листьях и растениях. Для проверки устойчивости трансгенных растений к фитопатогенам молодые листья инфицировали суспензией бактерий E. carotovora или заражали кусочками мицелия гриба Fusarium sporotrichioides [23, 24]. В качестве контроля служили листья нетрансформированных растений и трансгенных растений, трансформированных пустым вектором. Фитопатогенными бактериями (суспензия 103—105 клеток/мл) и грибами иноку-лировали черешки листьев трансгенных и не-трансгенных растений, помещали их на агаризо-ванную питательную среду МС в чашки Петри, выдерживали в закрытом состоянии при 24°С и 16-часовом световом дне и через 1—14 сут (в зависимости от вида патогена) оценивали степень повреждения. Целые растения заражали уколом иглы, смоченной в суспензии патогенных бактерий. Для заражения грибными патогенами кусочек агара с мицелием помещали
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.