ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2013, том 60, № 1, с. 61-65
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ВАКУОЛЯРНОИ Н+-АТФазы В КОРНЯХ ПРОРОСТКОВ ЯЧМЕНЯ РАЗНОГО ВОЗРАСТА ПРИ ДЕЙСТВИИ КАДМИЯ © 2013 г. Н. М. Казнина, А. Ф. Титов, Л. В. Топчиева, Г. Ф. Лайдинен, Ю. В. Батова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Карельского научного центра РАН, Петрозаводск Поступила в редакцию 01.03.2012 г.
Изучена экспрессия двух генов (HvVHA E и HvVHA с) вакуолярной Н+-АТФазы в клетках корней проростков ячменя (Hordeum vulgare L., сорт Зазерский 85) разного возраста в присутствии кадмия (100 мкМ). 3-дневные проростки выдерживали в течение 4 дней на растворе с кадмием, что приводило к торможению роста корня, которое сопровождалось усилением экспрессии гена HvVHA Е. При этом содержание восстановленного глутатиона (GSH) снижалось. В том случае, когда на раствор кадмия помещали 7-дневные проростки и также выдерживали их в течение 4 дней, несмотря на более высокое содержание металла в корне его рост не тормозился, а экспрессия обоих изученных генов резко усиливалась. Увеличивалось также количество GSH, очевидно, способствуя поддержанию высокой активности фермента. Сопоставив уровень экспрессии генов двух субъединиц вакуолярной Н+-АТФазы и устойчивость проростков разного возраста к кадмию, мы пришли к выводу об участии фермента в механизме повышения устойчивости к нему растений ячменя.
Ключевые слова: Hordeum vulgare — проростки — кадмий — вакуолярная Н+-АТФаза — экспрессия генов
DOI: 10.7868/S001533031301003X
ВВЕДЕНИЕ
Одним из наиболее важных механизмов деток-сикации тяжелых металлов (ТМ), в том числе кадмия, в клетке является их хелатирование в цитоплазме и транспорт в вакуоль [1]. Изоляция токсичных ионов в вакуоли осуществляется благодаря функционированию различных транспортных систем тонопласта [2], среди которых известные в настоящее время транспортеры САХ2 и САХ4, работающие как Сё2+/Н+-анти-портеры и способные, как полагают, перемещать свободные ионы металла через вакуолярную мембрану из цитоплазмы в вакуоль [3, 4]. Работу этих антипортеров обеспечивают протонные помпы тонопласта, в частности, вакуолярная Н+-АТФа-за, создающая электрохимический градиент, необходимый для сопряженного (вторичного) транспорта ионов металлов через тонопласт [5, 6].
По современным представлениям, вакуолярная Н+-АТФаза высших растений является белковым комплексом, состоящим из нескольких субъединиц, кодируемых разными генами [7, 8].
Сокращения: ТМ — тяжелые металлы; GSH — восстановленный глутатион.
Адрес для корреспонденции: Казнина Наталья Мстиславовна. 185910 Петрозаводск, Пушкинская ул., 11. Институт биологии Карельского научного центра РАН. Электронная почта: kaznina@krc.karelia.ru
При этом выявлено, что увеличение экспрессии генов некоторых из них в условиях действия стрессовых факторов сопровождается увеличением количества соответствующего фермента и, следовательно, его активности [9-11]. В свою очередь, повышение активности вакуолярной Н+-АТФазы сопровождается усилением транспорта ионов ТМ в вакуоль [12], в том числе и ионов кадмия [8]. Было высказано предположение о том, что за счет увеличения активности ан-типортеров вакуолярная Н+-АТФаза может повышать устойчивость растений к ТМ. Однако экспериментальных данных, подтверждающих это, крайне мало. Вместе с тем, изучение экспрессии генов отдельных субъединиц вакуолярной Н+-АТФазы в присутствии кадмия может поспособствовать лучшему пониманию механизма изоляции металла в вакуоли клеток и его детоксикации.
Исходя из вышеизложенного, целью нашего исследования явилось изучение экспрессии генов двух субъединиц вакуолярной Н+-АТФазы (HvVHA E и HvVHA с) в корнях растений ячменя разного возраста в присутствии кадмия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проводили с проростками ярового ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Зазерский 85. Се-
Таблица 1. Праймеры для проведения ПЦР в режиме реального времени
Ген Прямой праймер Обратный праймер
HvVHA-E 5'cgccgacgccaagatgaacgaca 5'agcactttgatacgggaagcatt
HvVHA-с 5'ааtctacggcctcatcatcg 5'cacgggatgagaggatgatg
мена проращивали в сосудах с песком при температуре воздуха 20-22°С, освещенности 10 клк, фотопериоде 14 ч. По достижении растениями возраста 3 (фаза прорастания семян) и 7 (фаза всходов) дней их переносили в пластиковые контейнеры (объемом 2 л) на половинный раствор Кнопа с добавлением микроэлементов (контроль). В опытных вариантах к питательному раствору добавляли кадмий в форме сульфата (100 мкМ).
Через 4 суток экспозиции на растворе с кадмием в корнях проростков определяли его содержание, оценивали влияние на рост корня, а также рассчитывали индекс устойчивости проростка методом корневого теста [13]. Помимо этого, в клетках корня определяли уровень экспрессии генов HvVHA Еи HvVHA с и измеряли количество восстановленного глутатиона (GSH).
Содержание кадмия в корнях и листьях определяли методом инверсионной вольтамперометрии с использованием полярографа АВС 1.1 ("Вольта", Россия). Разложение растительных образцов проводили в смеси HNO3 и H2O2 в соотношении 4 : 1 с использованием микроволновой системы подготовки проб марки МС-6 ("Вольта").
Индекс устойчивости (It) вычисляли по формуле: It = lCd/4, где lCd — прирост корня за 4 суток экспозиции в опытном варианте; 1к — прирост корня за это же время в контрольном варианте.
Уровень экспрессии генов определяли методом ПЦР. Тотальную РНК выделяли с помощью набора для выделения РНК YellowSolve ("Clono-gene"). Препарат РНК обрабатывали ДНКазой. Первую цепь кДНК синтезировали, используя набор для обратной транскрипции со случайными праймерами ("Силекс"). Использованные
Таблица 2. Содержание кадмия в корнях проростков ячменя разного возраста после 4-суточной экспозиции на растворе с металлом (100 мкМ) и индекс их устойчивости
Возраст проростков до обработки и экспозиция Содержание кадмия, мкг/г сырого веса It, усл. ед.
3-дневные + 4 суток с Cd 7-дневные + 4 суток с Cd 20.50 ± 0.68 27.02 ± 0.51 0.71 0.98
Примечание. В таблице представлены средние значения и их стандартные ошибки. Содержание кадмия в корнях растений контрольных вариантов составляет 0.23 ± 0.02 и 0.27 ± ± 0.03 мкг/г сырого веса соответственно.
праймеры представлены в табл. 1. ПЦР в режиме реального времени проводили на приборе iCycler iQ5 ("Bio-Rad", США) с оптической приставкой с использованием наборов с интеркалирующим красителем SYBR ("Синтол"). После амплификации для подтверждения специфичности ПЦР-продуктов осуществляли процедуру плавления.
Количество GSH определяли методом ВЭЖХ. После замораживания образцов корней в жидком азоте проводили экстракцию GSH. Для этого 20 мг материала гомогенизировали в 2 мл раствора ледяной 6.3 мМ диэтилтриаминпентауксусной кислоты ("Sigma") и 0.1% трифторуксусной кислоты ("Merck"). Гомогенат центрифугировали при 10000 об./мин и 4°С. Полученные экстракты подвергали предколоночной дериватизации с мо-нобромбинаме ("Sigma") согласно методике Sneller с соавт. [14]. Разделение GSH проводили в аналитической колонке марки Phenomenex Luna 5u С18 при температуре колонки 37°С и скорости потока 0.5 мл/мин. Количество GSH определяли по его стандарту ("Sigma"). Расчет площадей пиков осуществляли с помощью компьютерной программы МультиХром (v. 1,5Х).
Все представленные в статье данные являются средними из двух независимых опытов. Повтор-ность в пределах одного варианта опыта для разных показателей составляла от 6 до 20 растений. В таблицах и на рисунках представлены средние значения и их стандартные ошибки. Достоверность различий оценивали с помощью í-критерия Стьюдента при Р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проведенный анализ показал, что 4-дневная экспозиция 3- и 7-дневных проростков ячменя на растворе с кадмием приводила к значительному повышению его содержания в корнях. Причем у проростков, возраст которых до обработки составлял 7 дней, содержание кадмия в корнях было в 1.3 раза выше, чем у проростков, которым до обработки было 3 дня (табл. 2). Тем не менее, торможение роста корня наблюдалось только у более молодых: его прирост в опытном варианте был почти на 30% меньше, чем в контроле. Индекс устойчивости у них при этом составил 0.7. У более взрослых проростков негативное влияние кадмия на рост корня практически не наблюдалось, поэтому индекс устойчивости у них оказался близким к 1.0.
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ВАКУОЛЯРНОИ Н+-АТФазы В КОРНЯХ
63
ц 6 о
В
5
к s
о
13 4
а
с
о
m 3
л Я
о m „
о 2
л 2
HvVHA E
HvVHA c
Ген
Рис. 1. Уровень экспрессии генов НуУНА Е и НуУНЛ с в корнях проростков ячменя разного возраста после их 4-дневной экспозиции на растворе с кадмием (100 мкМ).
1 — 3-дневные + 4 суток экспозиции с С(1; 2 — 7-дневные + 4 суток экспозиции с С(± Уровень экспрессии генов у проростков контрольного варианта принят за единицу.
2
1
0
Обнаруженные различия в устойчивости проростков ячменя разного возраста к кадмию четко коррелировали с изменениями в уровне экспрессии изученных нами генов вакуолярной Н+-АТ-Фазы. Так, после 4-дневной экспозиции проростков на растворе с металлом экспрессия гена HvVHA E в клетках корня резко возрастала, но ее уровень оказался значительно более высоким у более взрослых проростков и превышал контроль в 5 раз, тогда как у более молодых — только в 2.3 раза (рис. 1). Уровень экспрессии гена HvVHA с при действии кадмия существенно возрастал (в 4 раза) лишь в корнях более взрослых растений.
Наряду с этим, экспозиция проростков на растворе с кадмием приводила к двукратному снижению количества GSH в корне более молодых из них и, наоборот, к двукратному увеличению содержания GSH в корне более взрослых проростков (рис. 2).
ОБСУЖДЕНИЕ
Впервые наличие протон-зависимого транспорта кадмия в вакуоль было экспериментально доказано в опытах in vivo с везикулами тонопласта корней овса [15]. Авторы показали, что АТФазы V-типа, к которым относится и вакуолярная Н+-АТФаза, могут обеспечивать работу Сё2+/Н+-ан-типортера. Позднее в присутствии кадмия было
обнаружено увеличение экспрессии генов некоторых субъединиц вакуолярной Н+-АТФазы, в частности, субъединицы с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.