ГЕНЕТИКА, 2012, том 48, № 11, с. 1245-1259
ОБЗОРНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИ
УДК 575.117.2:575.224:573.6:581
ЭКСПРЕССИЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ В РАСТИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ: НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ
© 2012 г. А. О. Вячеславова1, И. Н. Бердичевец1, А. А. Тюрин12, Х. Р. Шимшилашвили1,
О. Мустафаев1, И. В. Голденкова-Павлова1,2
1 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991
е-таП: irengold@vigg.ru
2Российский государственный аграрный университет — Московская сельскохозяйственная академия
им. К.А. Тимирязева, Москва 127550 Поступила в редакцию 16.04.2012 г.
В обзоре в сравнительном аспекте представлены данные об основных методах, которые используются в современной практике для стабильной и транзиентной экспрессии гетерологичных генов в растениях. На основе анализа литературы и результатов экспериментальных данных определены ключевые направления исследований в области гетерологичной экспрессии генов в растениях: моделирование метаболических путей; получение безмаркерных трансгенных растений; поиск новых регуляторных элементов и растительных генов, влияющих на эффективность экспрессии гетероло-гичных генов в растениях; разработка новых методов анализа трансгенных растений и новых подходов к экспрессии гетерологичных генов в растениях.
ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ПО ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ В РАСТЕНИЯХ
Для экспрессии гетерологичных генов в растениях исследователи используют две основные стратегии: стабильная (постоянная) экспрессия и транзиентная (временная) экспрессия. В настоящее время для стабильной экспрессии гетероло-гичных генов в растениях используют ядерную и пластидную трансформацию, а для транзиентной экспрессии — инфильтрацию агробактериями, трансформацию с использованием вирусных векторов и магнифекцию (трансфекция, опосредованная агробактериями).
Стабильная экспрессия
Ядерная трансформация. В настоящее время для ядерной трансформации растений исследователи в основном используют: а) агробактериальную трансформацию; б) биобаллистическую трансформацию; в) протопластную трансформацию; г) элек-тропорацию.
Агробактериальная трансформация в настоящее время является одним из наиболее широко используемых методов переноса чужеродного генетического материала в растения [1]. Почвенная фитопатогенная грамотрицательная бактерия А^гоЬас1егшт Ште/аает — превосходный естественный "генный инженер" и система переноса и экспрессии гетерологичных генов в растениях. Многочисленные исследования последних лет позволили получить высокоэффективные штаммы А^гоЬас1егшт, создать новые экспрессионные
векторы и разработать протоколы трансформации для различных видов растений. Это расширило спектр растений-хозяев, включая представителей многих видов высших растений, не только двудольных, но и однодольных [2—4].
Молекулярные механизмы процесса агробак-териальной трансформации подробно описаны в обзоре [5]. После взаимодействия с растительной клеткой агробактерии переносят часть плазмиды (И- или Ш-плазмиды для А. Ште/аает или А. rhizogenes, соответственно), так называемую область Т-ДНК в растительную клетку с последующей ее интеграцией в хромосому растения-хозяина. В процесс переноса и интеграции Т-ДНК вовлечены как компоненты агробактерий, так и растений [6]. При взаимодействии с агробактери-ями из растительной клетки высвобождаются специфические сахара и фенолы, которые взаимодействуют с рецепторами на клеточной мембране агробактерий. Сигнал от рецепторов через ряд посредников активирует vir-гены агробактерий, расположенных на Тьплазмиде. Белки, закодированные в последовательностях vir-генов, участвуют в образовании одноцепочечной Т-ДНК, а также присоединении и переносе Т-ДНК через клеточную мембрану агробактерий и растений. Комплекс Т-ДНК с У1г-белками транспортируется в цитоплазме и переносится в ядро растительной клетки. В ядре происходит удаление Ук-белков от Т-ДНК и последующая интеграция Т-ДНК в геном растительной клетки с участием растительных белков (рис. 1).
Рис.1. Схема процесса агробактериальной трансформации растительной клетки.
Область Т-ДНК включает в себя несколько ключевых генетических элементов, за счет которых в дальнейшем осуществляются интеграция (прямые повторяющиеся последовательности), селекция трансформированных клеток растений в присутствии селективного агента в питательной среде (ген селективного маркера, экспрессия которого контролируется промотором) и экспрессия целевых генов. За счет уникального свойства растительной клетки — тотипотентности из трансформированной клетки получают первичные трансформанты растений, а после молекулярного и физиолого-биохимического анализа из большого числа первичных трансформантов отбирают истинные трансгенные растения, в которых происходит экспрессия целевого гена с образованием белкового продукта.
В настоящее время определен ряд факторов, которые следует учитывать для эффективной агробактериальной трансформации растений. Это — генотип растения; используемый эксплант; штамм Agrobacterium; состав питательных сред; условия и продолжительность взаимодействия Agrobacteri-um и растительных эксплантов (стадии инокуляции и кокультивации) и другие [7].
Метод агробактериальной трансформации растений имеет целый ряд преимуществ, включая низкую копийность интегрированных последовательностей; возможность переноса последовательностей больших размеров; возможность экспрессии сложных генов, кодирующих мультимерные белки (например, иммуноглобулины); высокий уровень стабильной экспрессии (таблица). Однако, несмотря на видимую простоту метода, главным его недостатком остается зависимость эффективности трансформации от генотипа растения. В связи с этим часто требуется оптимизация метода для индивидуального вида растения или векторной конструкции. С точки зрения использования трансгенных растений, полученных методом аг-робактериальной трансформации, как высокоэффективных продуцентов целевых белков еще одним недостатком является недостаточно высокий выход целевого белка по отношению к общему растворимому белку. Другое препятствие, с которым могут столкнуться исследователи, — это за-молкание целевого гена в трансгенных растениях.
Биобаллистическая трансформация растений основана на физическом процессе переноса области Т-ДНК, которую в составе растительного век-
Сравнительная характеристика стабильной и транзиентной экспрессии генов в растениях
и М и н к
£
Стабильная экспрессия Транзиентная экспрессия
Характеристика Ядерная трансформация Пластидная трансформация агроинфильтрация вирусная инфекция
агробактериальная биобаллистическая протопластная биобаллистическая
Зависимость от генотипа Зависит Менее зависит Зависит Менее зависит Зависит Зависит
Диапазон растений-хозяев Широкий Широкий Ограничен Ограничен Ограничен Ограничен
Векторы Сложные Простые Простые Сложные Сложные Сложные
Возможность использования линейной ДНК Нет Есть Есть Есть Нет Нет
Перенос генов, имеющих размер более 1000 тпн Возможен Возможен Возможен Не возможен Возможен Возможен
Копийность (число встроек) Низкое число копий Множественные интеграции Т-ДНК и перестройки Низкое число копий Одна копия? Без интеграции Без интеграции
Посттрансляционные модификации белковых продуктов Возможны Возможны Возможны Не возможны Возможны Возможны
Уровень экспрессии Средний Низкий Низкий Высокий** Высокий Высокий
Эффективность трансформации Высокая* Средняя Низкая Очень низкая Высокая Высокая
Специфическое дорогостоящее оборудование Не требуется Требуется Не требуется Требуется Не требуется Не требуется
Трудоемкость процедур Простая Простая Сложная Сложная Простая Простая
Биобезопасность Относительная*** Относительная*** Отно сительн ая * * * Высокая**** Высокая***** Высокая*****
й Я чз
И
о о
и н и
43 §
о
"Ч Л
я Е
X
И Я О а
* Высокая эффективность трансформации для некоторых видов, но требуются специальные протоколы. ** Обычно от нескольких процентов от суммарного растворимого белка до физиологического максимума >50% от суммарного растворимого белка. *** Необходимо применение специальных подходов для предотвращения высвобождения трансгена в окружающую среду. **** Наследование пластид по материнской линии, пыльца не содержит пластид. ***** Не создается трансгенных растений. Производство большинства рекомбинантных белков может проводиться в контролируемых условиях.
ы
тора закрепляют на специальных частицах металлов (золото, вольфрам). Эти частицы переносят в геном растений с применением генной пушки ("обстрела растительной ткани"). В результате происходят интеграция и экспрессия генов, расположенных в области Т-ДНК в трансформированных клетках растений. Процедуры селекции и получения трансформантов растений осуществляют по такому же принципу, как и в случае трансформации растений с помощью Л. Ште/а-ciens. К настоящему времени этим способом получены трансгенные растения, относящиеся к различным семействам растительного царства [8]. С момента разработки этого метода в 1990 г. появилось и множество разновидностей биобаллистических установок. Различные принципы действия и особенности конструкций этих установок делают необходимой отработку условий баллистической трансформации для каждого устройства применительно к каждому виду растения [8].
На эффективность биобаллистической трансформации оказывают влияние разные факторы, которые разделяют на три группы — физические, химические и биологические. К физическим параметрам, которые необходимо подбирать экспериментально, относятся: величина давления гелия, необходимая для достаточного разгона микрочастиц-носителей ДНК; величина давления вакуума в камере с клетками-мишенями; расстояние ткани мишени от источника частиц и рассекающего фильтра; размер микрочастиц и их количество, используемое при выстреле; количество производимых по ткани мишени выстрелов и др. Среди химических параметров следует отметить наличие и концентрацию реактивов для преципитации ДНК на металлические частицы, а именно неорганических солей кальция, магния, органических компонентов (ПЭГ, глицерин, этанол, спермидин). В эту группу параметров входят также значение
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.