ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИИ, 2008, том 55, № 4, с. 571-578
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ЭКСПРЕССИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ДЕСАТУРАЗЫ FAD2 ШПИНАТА
В КЛЕТКАХ ТАБАКА
© 2008 г. Р. Тодорова
Институт биофизики, Болгарская академия наук, София, Болгария Поступила в редакцию 31.10.2007 г.
Локализацию процесса десатурации в растительной клетке изучали путем экспрессии гибридного гена, содержащего гены, кодирующие FAD2 (А 12 десатураза) шпината (Spinacia oleracea) и усиленный зеленый флюоресцентный белок (EGFP), под контролем 35$ промотора вируса мозаики цветной капусты. Гибридный белок был активен в БУ-2 клетках табака (Nicotiana tabacum). Изучали временные изменения в локализации FAD2-EGFP белка. На основании полученных результатов можно заключить, что процесс десатурации в растительных клетках протекает в эндоплазматиче-ском ретикулуме и плазматической мембране.
Ключевые слова: Spinacia oleracea - Nicotiana tabacum - BY-2 клетки - FAD2 десатураза - усиленный зеленый флюоресцентный белок - 35S промотор вируса мозаики цветной капусты - десату-рация - эндоплазматический ретикулум.
ВВЕДЕНИЕ
Содержание ненасыщенных ЖК в глицероли-пидах мембран растений, микроорганизмов и других организмов зависит от температуры их роста. Десатуразы ЖК (FAD), связанные с эндоплазма-тическим ретикулумом (ЭР) синтезируют лино-левую (18 : 2 А9цис, 12цис) и линоленовую (18 : 3 А9цис, 12цис, 15цис) кислоты, компоненты клеточных мембран и растительных масел [1]. Образование этих ЖК происходит путем последовательной десатурации олеиновой кислоты (18 : 1 А9цис) в линолевую с помощью ю12 десатуразы олеиновой кислоты (FAD2) и затем линолевой кислоты в линоленовую с помощью ю3 десатуразы ЖК (FAD3). Гены FAD растений очень консервативны [2].
ЖК растений синтезируются в пластидах, и их десатурация происходит в пластидах или в ЭР [3]. У растений и цианобактерий ацил-липид десатуразы обычно связаны с мембранами [4]. Они являются трансмембранными белками и локализованы в ЭР и мембранах хлоропластов [5]. В этио-пластах пшеницы галактозилтрансферазы были найдены как в протилакоидах, так и мембранах оболочки [6]. У цианобактерий активность
Сокращения: ЭР - эндоплазматический ретикулум; 35S CaMV - 35S промотор вируса мозаики цветной капусты; EGFP - усиленный зеленый флюоресцентный белок (от enhanced green fluorescent protein); FAD - десатураза ЖК (от fatty acid desaturase); SRP - частица распознавания сигнала (от signal recognition particle).
Адрес для корреспонденции: R. Todorova. Bulgaria, 1113 Sofia, ul. Acad. G. Bonchev, Bl 21. Institute of Biophysics, Bulgarian Academy of Sciences. E-mail: todorova@obzor.bio21.bas.bg
1,2-диацилглицеролглюкозилтрансфразы была обнаружена как в тилакоидах, так и в цитоплаз-матических мембранах [7]. Поэтому было высказано предположение, что синтез глицеролипидов может происходить как в тилакоидах, так и в оболочке хлоропластов и в клетках цианобактерий [8].
Гибридный ген, содержащий последовательности А12 десатуразы олеиновой кислоты шпината (FAD2) и усиленный зеленый флюоресцентный белок (EGFP, от enhanced green fluorescent protein), был сконструирован и экспрессирован в BY-2 клетках табака под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (35S CaMV) с целью изучения внутриклеточной локализации де-сатуразы.
МЕТОДИКА
Построение экспрессионного вектора p35S : FAD2 : EGFP. кДНК А12 десатуразы (FAD2) Ara-bidopsis thaliana (1152 п.н.) [9] клонировали в SmaI сайты pBluescript II KS+ ("Stratagene"). Плазмиду расщепляли EcoRI и XbaI, и меченый зонд использовали для скрининга библиотеки кДНК в ÀZAPII фаге [10]. Фрагмент ДНК длиной 1629 п.н. гена FAD2 десатуразы Spinacia oleracea (номер доступа в Генбанке AB094415 [11]) клонировали, в сайты рестрикции EcoRI и HindIII pBluescript SK + II для получения pBlue:FAD2 конструкции. pEGFP вектор ("Clontech") расщепляли NcoI и ApaI, и липкие концы NcoI достраивали с помощью Т4 полиме-разы. Ген EGFP с тупыми концами лигировали в HindIII и ApaI, подвергали рестрикции, и HindIII концы pBlue : FAD2 вектора достраивали, чтобы
получить pBlue : FAD2 : EGFP вектор, содержащий гибридный ген FAD2:EGFP. Этот вектор расщепляли по EcoRI сайтам, и после достраивания липких концов лигировали в SacI and XbaI сайты, затем снова расщепляли и встраивали в 5SKTP1 вектор [12], получая экспрессионный p35S : FAD2 : EGFP вектор, содержащий 35S CaMV промотор и NOS терминатор. Эту конструкцию подвергали ПЦР и секвенировали в ABI Prism 310 генном анализаторе.
Экспрессия гибридного FAD2 : EGFP гена в клетках табака. BY-2 клетки табака (Nicotiana tabacum L., сорт Bright Yellow 2) выращивали в суспензионной культуре на МС-среде, как описано в [13], до экспоненциальной фазы, фильтровали и переносили на пластины агара с BY-2 средой. BY-2 клетки трансформировали p35S : FAD2 : EGFP вектором во время экспоненциальной фазы роста (3 дня) бомбардировкой микрочастицами золота (1.6 мкм), используя Bio-Rad Particle Delivery System. Одну пластинку с BY-2 клетками обстреливали дважды 3 мкг векторной ДНК, иммобилизованной на 1 мкг порошка золота (частицы размером 1.6 мкм) в спермидине и CaCl2 при давлении гелия 63.29 атм при расстоянии между пушкой и мишенью в 6 см.
После трансформации p35S : FAD2 : EGFP пластины инкубировали в темноте при двух разных температурах (18 и 22°С). Экспрессию гибридного гена FAD2:EGFP оценивали после 6, 12, 18, 24, 30, 42, 48, 66 и 72 ч.
Локализацию белка FAD2-EGFP в BY-2 клетках определяли с помощью эпифлюоресцентного микроскопа (Bx50 BX-FLA, "Olympus", Япония) с набором фильтров 80P000 PINKEL 602 ("Photo-metrics", Япония) в светлом поле ("Nomarski optics") при возбуждении синим светом (470-490 нм) с помощью фильтров NIBA и MF ("Olympus") и увеличении x40. Для поглощения фотонов использовали Polaroid 1600 (Provia Fujichrome color reverse film). Все опыты проводили в трех повтор-ностях.
Структуру белков FAD2, EGFP, FAD2-EGFP и EGFP-FAD2 предсказывали, используя программы SOSUI [http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui], TMPRED [http://www.ch.embnet.org], PSOFT [http://www.psoft.org], [http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp], WOF PSOFT [http://biocaml.org/ipsort] и PredictPro-tein [http://www.predictprotein.org].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ген, кодирующий FAD2 десатуразу из ЭР и содержащий N-концевую регуляторную область (последовательность Shine-Delgarno 180 п.н. перед инициирующим ATG кодоном в 5'-нетрансли-руемой области открытой рамки считывания и сайт инициации трансляции), использовали для
получения гибридного FAD2:EGFP гена (рис. 1). Нуклеотидную последовательность FAD2 десату-разы шпината определяли секвенированием. Была найдена открытая рамка считывания длиной 1152 п.н., кодирующая белок из 384 аминокислот с предсказанной мол. м. 44.2 кД. Для экспрессии гибридного гена FAD2:EGFP был сконструирован p35S : FAD2 : EGFP вектор, содержащий 35S CaMV промотор и NOS терминатор (рис. 2).
Стабильную интеграцию гибридной ДНК в BY-2 клетки подтвердили с помощью ПЦР и in vivo экспрессии в этих клетках. Степень трансформации оценивали в течение 18-72 ч роста клеток после бомбардировки: подсчитывали число трансформантов под флюоресцентным микроскопом, используя NIBA и MF фильтры для отсечения автофлюоресценции хлоропластов при возбуждении синим светом (470-490 нм). Контрольные фото были сделаны при освещении белым светом.
Временной ход экспрессии гибридного FAD2:EGFP гена изучали при двух разных температурах: 18 и 22°C (рис. 3-5). Изменения в распределении гибридного белка при 22°C происходили на несколько часов раньше, но общая картина была одинаковой при обеих температурах (таблица). Двойная бомбардировка повышала эффективность трансформации примерно вдвое, от 4045% после однократной бомбардировки до 8090%. Метод переноса гена давал воспроизводимые результаты и был высоко эффективным: в результате получали жизнеспособные трансгенные клетки. Они росли с такой же скоростью, что и контрольные нетрансформированные клетки, не обнаруживали никаких повреждений и были способны к регенерации. При трансформации соблюдали стерильные условия. Размер клеток был примерно 29-30 мкм.
Через 18 ч после трансформации гибридный FAD2-EGFP белок можно было видеть в сильно флюоресцирующих ядрах и вокруг них (рис. 3 а, 36). Через 24 ч он был заметен во всех клетках и предпочтительно локализовался в ЭР, в то время как его количество в ядрах снижалось. Через 48 ч гибридный белок был преимущественно в плазматической мембране (рис. 4а-4в). Еще позже (через 72 ч после трансформации) интенсивность окрашивания плазматической мембраны и ядра снова увеличивались (рис. 5а, 56). Позже окрашивание всех структур начинало блекнуть из-за приближающейся гибели клеток, вызываемой избыточным накоплением гибридного белка, высокие концентрации которого могут быть токсичными.
Можно заключить, что местами локализации FAD2, экспрессируемой совместно с EGFP, являются преимущественно плазматическая мембрана и ЭР. Культивируемые трансгенные клетки оставались интактными и росли с той же скоростью, что и нетрансформированные клетки. По-
atgggtgcaggtgggagatctattcctccatcggcgagaaaggagaaatctgatgcattg
М
I
К
К
о
aacagagtaccatacgaaaaaccaccattcacactagggcagataaaaaaagccatccca
N К V
Е К
Е Т Ь С О
К К А
cctcattgcttcaaacgctctgtgctacgctctttctcctatgtggtttatgatttcacc
РНСГККЗУЪКЗРЗУУУУЭГТ attgcgttcctcctctactatgttgctactaactacatccacctccttccaaagcctttc
I
V
N
Н
К
aactacttggcttggcctgtgtatggatttgtccaaggctgtgttcttaccggtgtttgg
N
И
V
V
V
V и
gttatagcccatgaatgtggccaccatgcct1:cagtgattaccagtggctcgatgacact
V
А Н
С й Н Н А
И
gttggcttagtcctccactcgttccttcttgtgccatatttctcatggaaatacagtcac
УСЬУЬНЗЕЪЬУРУЕЗИКУЗН aggcgccatcactcaaacactggttcaatggagaaagatgaagtttttgtaccccaaaga
н н
и
м
к о
V
V
aaggaaaatatgtcatggttttccaagtatcttagcaacccacctggacgaatcctgacc
К
н м
и
к
N
I*
Gttgttgtgacgctaacccttggctggcctttgtatcttctgtttaatgtatcgggtagg
V V
И
N V
aaatatgagcgttttgcttgccattatgacccatcctctccaatctactcggaccgtgag
КУЕ1*ЕАСНУРР35Р1У50КЕ aggcttcaaatattcatttctgatgttgggatttcgatagtggcttttgggctttatcac
cttgcagctgccaaaggaatttcatgggtgttgtgtgtatatgggggtccattgcttgtt
К
И
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.