ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 5, с. 786-789
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 581.1
ЭКСПРЕССИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ КОФЕИНСИНТАЗЫ
В РАСТЕНИЯХ ЧАЯ
© 2007 г. Ю.-Х. Ли*' **, В. Гу**, Ш. Ие***
* Колледж биологии, Университет Уханя, Ухань, Китай ** Колледж садоводства и лесоведения, Сельскохозяйственный университет Хуачжуна, Ухань, Китай *** Кафедра биологии и химии, Университет города Гонконга, Гонконг, Китай
Поступила в редакцию 10.08.2006 г.
Кофеинсинтаза чая (КС) - основной фермент синтеза кофеина в растениях чая (Camellia sinensis L.). Мы систематически исследовали экспрессию этого фермента и с помощью нозерн-блот-анализа обнаружили, что она была эффективной в листьях, но не в стеблях или корнях растений. Экспрессия была более активной в листьях, выросших летом, в сравнении с весенними листьями. Уровень экспрессии заметно возрастал в листьях затененных или удобренных растений. При сравнении листьев одного и того же побега было обнаружено, что экспрессия была гораздо более активна в молодых листьях (почка и первый лист), чем в более развитых втором и третьем листьях. In situ гибридизация РНК показала, что экспрессия гена КС была более активна в палисадной паренхиме и эпидермисе листьев, покрытом кутикулой, чем в губчатой паренхиме и гиподерме.
Camellia sinensis - кофеинсинтаза - экспрессия гена - нозерн-блоттинг - in situ гибридизация РНК -листья чая
ВВЕДЕНИЕ
Кофеин - важный пуриновый алкалоид растений чая. 99% кофеина чая содержится в листьях растений, достигая 2-5% [1, 2]. Кофеин не синтезируется в стебле, корнях и семядолях чая [3], но может образовываться в цветочных почках [4-6]. Кофеинсинтаза (КС), обладает двойной ферментативной активностью, как 3-^-метилтрансфера-за (3-NMT) и 1-Л^-метилтрансфераза (1-NMT). Она катализирует обе финальных стадии синтеза кофеина, последовательно добавляя две метиль-ные группы к 7-метилксантину с образованием теобромина и затем кофеина [7, 8]. В 1976 г. Suzuki с соавт. [9] впервые экстрагировали КС из свежесобранных листьев чая. С тех пор КС чая начали активно исследовать в связи с важной ролью кофеина для здоровья. Только в 1990 г. Kato с соавт. [8] очистили и охарактеризовали этот фермент. Ген КС из листьев чая, с последовательностью кДНК длиной 1439 т.п.н., был успешно клонирован [10]. Все увеличивающаяся потребность в получении новых сортов чая с низким содержанием кофеина привела к использованию новых
Сокращения: ДИГ - дигоксигенин; КС - кофеинсинтаза; НСТ - нитро-синий тетразолий; NMT - ^-метилтрансфераза. Адрес для корреспонденции: Yuan-Hua Li. College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070 China. Fax: +86-27-87282010; e-mail: Liyuanhua@ mail.hzau.edu.cn
биотехнологий, таких как применение антисмысловой РНК, для дальнейшего изучения КС чая.
В данной работе мы систематически исследовали экспрессию гена КС чая, чтобы охарактеризовать связь между распределением кофеина и активностью КС, а также продолжить исследование роли КС в синтезе кофеина.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Свежие молодые листья (почки и первые три листа), стебли (одревесневшие веточки) и питающие корни растений 4 сортов чая (Camellia sinensis L., Fuding Dabai Cha, Fuding Dahao Cha, Fuan Dabai Cha и Meizhan) собирали с растений, выращиваемых на опытной ферме сельскохозяйственного университета Хуачжуна (Китай). Fuding Dabai Cha - стандартный сорт, в то время как Fuding Dahao Cha, Fuan Dabai Cha и Meizha - типичные сорта для производства высококачественного зеленого, черного и улонг чая, соответственно. Fuding Dahao Cha содержит много аминокислот, особенно теанина, и пригоден для приготовления высококачественного зеленого чая. Растения сорта Fuan Dabai Cha имеют крупные листья с высоким содержанием полифенолов; его используют для производства черного чая. Сорт Meizhan пригоден для приготовления чая улонг. У него жесткие хрупкие листья, толстый эпидермис, и в молодых стеблях много легко экстрагируемых водой аминокислот и арома-
тических соединений, причем других, чем в листьях.
Для сравнения разных условий выращивания часть растений удобряли азотом (46% N, Hubei Yi-hua Group, Китай); другие растения затеняли с помощью специальной сетки (Zhejiang Taizhou Sunshade Net Factory, Китай). Обе обработки проводили перед сбором листьев летом. Азотное удобрение вносили один раз в количестве 5.8 кг/акр. Степень затенения составляла 70%.
Выделение РНК и нозерн-блоттинг. Общую РНК выделяли из листьев, стеблей и корней растений чая, используя реагент TRIzol® и протокол, описанный производителями ("Gibco-BRL", Германия). Нозерн-блоттинг проводили, как описано в [11]. Кратко, 20 мкг общей РНК фракционировали в 1.5%-ном агарозном геле, содержавшем формальдегид, и переносили на нейлоновую мембрану (NYTRAN®, "Schleicher and Schuell", США). Обработанную мембрану инкубировали с a-32P-кДНК при 65°С в течение ночи и тщательно отмывали. Исследовали экспрессию гена КС чая в разных вегетативных органах растений, а также в листьях разных сортов чая, выращенных при разных условиях.
In situ гибридизация РНК. Первые листья растений чая фиксировали в 4%-ном параформаль-дегиде, обезвоживали в серии разведений этанола, обрабатывали ксилолом и заливали парафином, как описано Drews [12]. Срезы толщиной 8 мкм прикрепляли к предметным стеклам, покрытым полилизингидробромидом. Меченные дигоксигенином (ДИГ) смысловые и антисмысловые РНК-зонды транскрибировали на кДНК КС чая, переваренной BamHl или Xbal, с помощью T7 (антисмысловой) или T3 (смысловой) РНК поли-меразы. В качестве зонда использовали антисмысловую РНК, комплементарную З'-нетранслируе-мой области в гене КС чая. In situ гибридизацию мРНК КС чая проводили на срезах сегментов листьев с радиоактивным РНК зондом при 5°C в течение ночи. Стекла промывали дважды в 2 х SSC (от standard saline citrate) при комнатной температуре, затем в 1 х SSC и 0.1 х SSC при 57°C, каждый раз по 15 мин. РНК, меченную ДИГ, определяли с помощью анти-ДИГ конъюгата щелочной фос-фатазы по протоколу производителей ("Boehring-er Mannheim", Германия). Нитро-синий тетразо-лий (НСТ) смешивали с 5-бром-4-хлор-3-индо-лилфосфатом и добавляли поливиниловый спирт для реакции индоксила с НСТ по Block и Debrou-wer [13]. После развития окраски, катализируемой щелочной фосфатазой, получали нерастворимый голубой осадок. Стекла просматривали под микроскопом Olympus BX60 ("OLYMPUS", Япония) и фотографировали, используя цветную негативную пленку 100 ASA.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Нозерн-блоттинг гена КС чая
Для исследования экспрессии гена КС в разных вегетативных органах растений чая сравнивали содержание ее мРНК в листьях, стеблях и корнях сорта Fuding Dabai Cha, используя для но-зерн-блоттинга зонд, комплементарный к 3'-не-транслируемой области кДНК КС чая (номер доступа в Генбанке AB031280). Эффективная экспрессия гена происходила только в листьях, но не в стеблях и корнях (рис. 1а). При сравнении разных сортов чая было показано, что ген был активен в листьях всех 4 сортов (рис. 16). Экспрессия в почке и первых трех листьях, развившихся летом, была сильнее, чем в весенних листьях (рис. 1в). Экспрессия в почке и первых трех листьях затененных или удобренных растений была выше, чем в контрольных растениях (рис. 1г).
Мы также сравнивали экспрессию КС гена чая в молодых листьях сорта Fuding Dabai Cha разного возраста (рис. 1д). Экспрессия происходила более активно в почках и первых листьях, чем в более старых вторых и третьих листьях.
In situ РНК гибридизация и локализация КС в тканях листа чая
Рис. 2 представляет данные in situ гибридизации РНК в первых листьях трех сортов чая. Очевидно, что экспрессия КС происходила, главным образом, в палисадной паренхиме и эпидермисе, покрытом кутикулой, и была гораздо слабее в губчатой паренхиме и гиподерме.
ОБСУЖДЕНИЕ
Помимо растений чая около 60 видов растений в мире содержат кофеин, и некоторые из них содержат много кофеина. Так, растения Coffea ага-bica содержат 1-2% кофеина, Theabronma cacao -0.03%, Cola acuminate - 1.5%, Paullinia capana ->4% и Ilex paraguariensis - 0.7% [14]. В растениях чая б0льшая часть кофеина присутствует в листьях, в то время как в других видах растений - в плодах [14].
Поскольку почти весь кофеин был найден в свежесобранных листьях чая, считалось, что его синтез происходит только в листьях, но не в стеблях и корнях [1-3]. Было обнаружено, что теобромин, предшественник кофеина, также присутствует только в свежесобранных листьях, и было обнаружено включение 8-14С-аденина в теобромин и кофеин [15, 16]. Кофеин был найден во всех растениях чая; его содержание было выше в почках и первых листьях по сравнению со вторыми и третьими листьями. Кроме того, содержание кофеина было выше в летних, чем в весенних листьях, оно повышалось при затенении и удобре-
788 ЛИ и др.
1 2 3 4 5 6 7
8 9 10 11 12 13
КС КС •• КС
рРНК рРНК рРНК
(в) (г) (д)
Рис. 1. Нозерн-блоттинг.
В качестве зонда использовали кДНК, соответствующую гену КС чая (верхние панели); на нижних панелях - рРНК, используемая в качестве контроля нагрузки.
a - экспрессия гена КС чая у сорта Fuding Dabai Cha: 1 - почка и первые три листа, 2 - лигнифицированные веточки, 3 - питающие корни; б - экспрессия гена КС в молодых листьях 4 сортов чая: 4 - Fuding Dabai Cha, 5 - Fuding Dahao Cha, 6 - Fuan Dabai Cha, 7 - Meizhan; в - экспрессия гена КС в молодых листьях сорта Fuding Dabai Cha: 8 - летние листья, 9 - весенние листья; г - экспрессия гена КС в молодых листьях сорта Fuding Dabai Cha: 10 - листья затененных и удобренных растений, 11 - листья необработанных растений; д - экспрессия гена КС в листьях одного побега разного возраста: 12 - почка и первый лист, 13 - второй и третий листья.
Рис. 2. Анализ экспрессии гена КС чая с помощью in situ РНК гибридизации.
Образцы первых листьев были собраны с растений сортов Fuding Dabai Cha (а), Fuding Dahao Cha (б) и Fuan Dabai Cha (в). Антисмысловая РНК, комплементарная к 3'-нетраслируемой области гена КС чая, была использована в качестве зонда. Темное окрашивание показывает места экспрессии гена на срезах листа.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.