научная статья по теме ЭКСПРЕССИЯ ИСКУССТВЕННОГО ГЕНА АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА ЦЕКРОПИНА Р1 ПОВЫШАЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ К ФИТОФТОРОЗУ И БЕЛОЙ ГНИЛИ Математика

Текст научной статьи на тему «ЭКСПРЕССИЯ ИСКУССТВЕННОГО ГЕНА АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА ЦЕКРОПИНА Р1 ПОВЫШАЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ К ФИТОФТОРОЗУ И БЕЛОЙ ГНИЛИ»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 415, № 1, с. 129-131

^ ОБЩАЯ

БИОЛОГИЯ

УДК 575.1:582.951.4

ЭКСПРЕССИЯ ИСКУССТВЕННОГО ГЕНА АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА ЦЕКРОПИНА Р1 ПОВЫШАЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ К ФИТОФТОРОЗУ И БЕЛОЙ ГНИЛИ

© 2007 г. Н. С. Захарченко, Е. Б. Рукавцова, А. Т. Гудков, А. А. Юхманова, Л. А. Школьная, К. И. Кадо, Я. И. Бурьянов

Представлено академиком А.И. Мирошниковым 17.01.2007 г. Поступило 17.01.2007 г.

Антимикробные пептиды проявляют значительную бактерицидную и фунгицидную активности и входят в состав врожденной иммунной системы всех эукариотических организмов [1, 2]. Характерным свойством антимикробных пептидов является их суммарный положительный заряд и амфифильность. Антимикробные пептиды вызывают лизис клеток бактерий и грибов, нарушая целостность их мембран, однако не влияют на клетки животных и растений [3, 4]. Устойчивость эукариотических клеток к синтезируемым ими положительно заряженным антимикробным пептидам объясняется, по-видимому, нейтральным зарядом их мембран, в то время как клеточные мембраны микроорганизмов заряжены отрицательно и легко с ними взаимодействуют. Расширение спектра антимикробных пептидов в растительной клетке является перспективной стратегией защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов [5-9]. В настоящее время установлена структура и исследованы свойства более 100 антимикробных пептидов различных классов. Однако изучение влияния гетерологичных антимикробных пептидов на устойчивость растений к бактериальным и грибным фитопатогенам проведено на ограниченном количестве этих соединений и показало противополжные результаты их эффективности [10]. Возможно, это объясняется различной стабильностью пептидов в клетках различных видов и сортов растений. Ранее было показано повышение устойчивости трансгенных растений табака с геном антимикробного пептида цекропина Р1 к фитопатогенным бактериям, включая псевдомонады и эрвинии [9]. Цель

Филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Пущино Московской обл. Институт белка

Российской Академии наук, Пущино Московской обл.

настоящей работы - изучение влияния экспрессии искусственного гена антимикробного пептида цекропина Р1 в трансгенных растениях картофеля на их устойчивость к фитопатогенным грибам. Мы показали, что такие растения картофеля приобретают существенную устойчивость к тестируемым грибам Sclerotinium sclerotiorum и Phytoph-thora infestans, вызывающим соответственно белую гниль и фитофтороз.

Для трансформации растений использован аг-робактериальный бинарный вектор pGA482 c искусственным геном cecP1 зрелой формы антимикробного пептида цекропина Р1 [11] под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и с маркерным геном устойчивости к канамицину nptII [9]. Этот вектор был перенесен в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90RK) и применен для трансформации растений картофеля сорта Дезире по описанной методике [12]. В ходе трансформации было получено 48 линий первичных трансформантов путем селекции на среде, содержащей канамицин (50 мг/л). Растения, использованные для анализа, предварительно проверяли на отсутствие агро-бактерий в их тканях. Присутствие гена цекропина Р1 в трансгенных растениях картофеля было подтверждено методом ПЦР. Амплификация фрагмента ДНК размером 104 п.о. соответствовала полному размеру гена цекропина Р1.

Присутствие мРНК цекропина Р1 определяли нозерн-блот-анализом тотальной РНК, выделенной из трансгенных растений всех полученных линий. Гибридизация с меченным 32Р-зондом, содержащим структурную часть гена сесР1, показала, что во всех трансгенных растениях происходил синтез соответствующей мРНК. В контрольных растениях сигнал, соответствующий экспрессируе-мому гену, отсутствовал. Отмеченное различие в интенсивности сигналов мРНК в разных линиях трансгенных растений может быть связано с различной экспрессией гена сесР1 в различных хро-

130

ЗАХАРЧЕНКО и др.

Рис. 1. Вестерн-блот-анализ трансгенных линий картофеля, содержащих ген cecPl. 1 - 10 нг синтетического цекропина P1; 2 - белковый экстракт контрольного растения; 3-9 - белковые экстракты трансгенных растений (линии 1-7).

мосомных областях его интеграции в ядерный геном растения, что подтвердили результаты анализа содержания цекропина Р1.

Иммуноферментный анализ цекропина Р1 проведен с помощью полученных поликлональ-ных кроличьих антител к этому синтетическому пептиду. Цекропин Р1 получен методом твердофазного синтеза. Наблюдаемые различия в транскрипционном уровне экспрессии гена cecPl у независимых линий трансгенных растений соответствовали уровню синтеза цекропина Р1 у этих растений, наблюдаемому с помощью вестерн-блот-анализа (рис. 1). Этим методом и методом аналитической гельфильтрации бесклеточного экстракта, очищенного от пигментов и низкомолекулярных веществ, молекулярная масса цекропина Р1, синтезируемого в трансгенных растениях, определена равной 3.4 кДа, что соответствует молекулярной массе синтетического цекропина Р1 (рис. 2). Количество цекропина Р1, синтезируемого в клетках различных линий растений, варьировало на уровне 0.002-0.006% от общего растворимого белка.

Устойчивость трансгенных растений к фито-патогенным грибам Ph. infestans и S. sclerotiorum проверяли на листовых эксплантах, клубнях и целых растениях, растущих как in vitro, так и в закрытом грунте. На поверхность эксплантов наносили суспензию спор Ph. infestans или небольшой фрагмент мицелия S. sclerotiorum. Степень повреждения листьев и клубней оценивали спустя 1014 сут после заражения. Заражение фитофторой целых растений картофеля, растущих in vitro и in vivo, проводили, нанося суспензию спор Ph. infestans на листовую и стеблевую поверхности растений. Результаты анализов показали существенную устойчивость трансгенных растений и их отдельных эксплантов к фитопатогену Ph. infestans (рис. 3). Аналогичные результаты получены и для S. sclerotiorum. Испытания трансгенных растений картофеля, растущих в условиях закрытого грунта, также показали устойчивость растений к фитофторозу и белой гнили.

Существующие в литературе противоречивые данные о защитном эффекте исследованных пептидов и их производных в трансгенных растениях могут объясняться различной скоростью их деградации эндогенными пептидазами в клетках раз-

Время удержания, мин

Рис. 2. Высокоэффективная гельфильтрация цекропина Р1 на колонке Superdex Peptide (HR 10/30). Сплошная линия - оптическое поглощение при 280 нм. Штриховая линия - детекция цекропина Р1 по антимикробной активности. А - цитохром С (12.4 кДа), В - цекропин P1 (3.4 кДа), C - глицин (75 Да).

личных видов и сортов растений [13]. Не исключено, что некоторые структуры антимикробных пептидов могут оказаться достаточно стабильными в клетках определенных видов растений.

Наблюдаемый в настоящей работе высокий защитный эффект синтетического гена cecPl в трансгенных растениях картофеля против фито-патогенных грибов Ph. infestans и S. sclerotiorum может объясняться особенностями его структуры. До настоящего времени другими исследователями были получены трансгенные растения, содержащие в качестве антимикробных пептидов в основном дефензины с ß-структурой. Используемый в нашей работе цекропин Р1 относится к пептидам с линейной а-структурой и способен к образованию одной длинной а-спирали при участии практически всех аминокислотных остатков [14].

ЭКСПРЕССИЯ ИСКУССТВЕННОГО ГЕНА

1 2

Рис. 3. Повышенная устойчивость трансгенных растений картофеля к Ph. infestans. 1 - контрольное не-трансформированное растение (полная гибель); 2 -трансгенное растение (нормальный рост).

Таким образом, нами впервые использован искусственный ген цекропина Р1 для получения трансгенных растений картофеля с повышенной устойчивостью против патогенных грибов Ph. in-festans и S. sclerotiorum.

131

Полученные плазмидные конструкции можно в дальнейшем использовать для трансформации широкого круга сельскохозяйственных растений и исследования их устойчивости против микробных патогенов.

Авторы выражают благодарность Ю.Т. Дьякову и Л.В. Маслиенко за предоставленные штаммы фитопатогенных грибов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 04-04-48648, 06-08-81008, 07-0400235) и Программы Президиума РАН "Динамика генофондов".

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Boman H. // Annu. Rev. Immunol. 1955. V. 13. P. 61-92.

2. Térras F.R.G., Eggermont K, Kovaleva V. et al. // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 573-588.

3. Hyltmark D, Engstrom A., Bennich H. et al. // Europ. J. Biochem. 1982. V. 127. P. 207-217.

4. Mills D, Hammerschlag FA. // Plant Sci. 1993. V. 93. P. 143-150.

5. Jaynes J.M., Nagpala P, Destefano-Beltran L. et al. // Plant Sci. 1993. V. 89. P. 43-53.

6. Ohshima M, Mitruhara I, Okamoto M. et al. // Biochemistry. 1999. V. 125. P. 431-435.

7. Парашина ЕВ, Шаденков A.A., Лаврова H.B, Аве-тисов В.А. // Биотехнология. 1999. T. 6. С. 35-41.

8. Бурьянов Я.И., Кадо К.И. // Биоорган. химия. 1999. Т. 25. С. 903-910.

9. Захарченко H.C., Рукавцова Е.Б., Гудков АЛ, Бурьянов Я.И. // Генетика. 2005. Т. 41. С. 1445-1452.

10. Allefs S., Florask D, Hoogendoorn C, Stiekema W. // Amer. Potato J. 1995. V. 72. P. 437-445.

11. Martemyanov KA, Spirin A.S., Gudkov A.T. // Biotech-nol. Lett. 1996. V. 18. P. 1357-1362.

12. Rocha-Sosa M, Sonnewald U, Frommer W. et al. // EMBO J. 1989. V. 8. P. 23-29.

13. Owens L.D., Heutte T.M. // Mol. Plant. Microbe Interact. 1997. V. 10. P. 525-528.

14. Sipos D, Andersson M, Ehrenberg A. // Europ. J. Biochem. 1992. V. 209. P. 163-169.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Математика»