МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 1, с. 86-95
= ИММУНОБИОТЕХНОЛОГИЯ =
УДК 577.151.7
ЭКСПРЕССИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ
© 2011 г. А. В. Захаров1, И. В. Смирнов1, 2, М. В. Серебрякова3, М. А. Дронина1, А. В. Казначеева1, И. Н. Куркова1, А. А. Белогуров1, 4, A. Friboulet5, Н. А. Пономаренко1, А. Г. Габибов1, 2, 4*, Т. В. Бобик1**
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, 117997 2Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119991 3Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Росздрава, Москва, 119992
4Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, 119334 5Université de Technologie de Compiègne, UMR 6022 CNRS, BP 20529, 60206 Compiègne, Cedex, France Поступила в редакцию и принята к печати 16.08.2010 г.
Экспрессия рекомбинантных антител в культурах клеток млекопитающих считается сегодня одной из важных задач иммунобиотехнологии. Альтернативный подход, позволяющий относительно быстро получать широкий репертуар функционально активных иммуноглобулинов и их фрагментов, заключается в экспрессии их в дрожжевых системах. В настоящей работе получены экспрессионные штаммы мети-лотрофных дрожжей Pichia pastoris, секретирующие одноцепочечное каталитическое антитело человека А. 17 (A.17scFv), его Fab-фрагмент (A.17Fab) и полноразмерную легкую цепь (A.17Lch). Изучена функциональная активность полученных рекомбинантных белков. Показано, что одноцепочечное антитело А.17 и его Fab-фрагмент способны специфически связывать и трансформировать фосфорорганиче-ские соединения. Модификация легкой цепи антитела фосфонатом Х только в составе полного вариабельного домена антитела свидетельствует об участии обеих цепей антитела А.17 в формировании его активного центра. Определены константы равновесия (й"дас) образования нековалентного комплекса и константы скорости первого порядка (k2) реакции ковалентной модификации полученных A.17scFv и A.17Fab и-нитрофенил-8-метил-8-азабицикло[3.2.1]фосфонатом (фосфонат Х), необратимым ингибитором сериновых гидролаз. Сравнение кинетических параметров реакции позволяет утверждать, что исследуемые белки обладают реакционной способностью, сравнимой со способностью полноразмерного и одноцепочечного антитела А.17, продуцируемых, соответственно, в клетках СНО и Escherichia coli.
Ключевые слова: каталитические антитела, рекомбинантные антитела, системы экспрессии в Pichia pastoris.
EXPRESSION OF THE CATALYTIC ANTIBODIES IN EUKARYOTIC SYSTEMS, by A. V. Zakharov1, I. V. Smirnov1 2, M. V. Serebryakova3, M. A. Dronina1, A. V. Kaznacheeva1, I. N. Kurkova1, A. A. Belogurov1, 4, A. Friboulet5, N. A. Ponomarenko1, A. G. Gabibov1, 2 4*, T. V. Bobik1** (1Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, 117997 Russia; e-mail: *gabibov@gmail.com; **bobik_tanya@mail.ru; 2 Chemical Department, Moscow State University, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; 3Research Institute of Physical-Chemical Medicine, Moscow, 119992 Russia; 4Institute of Gene Biology, Moscow, 119334 Russia; 5Universite de Technologie de Compiegne, UMR 6022 CNRS, BP 20529, 60206 Compiegne, Cedex, France). Expression of recombinant antibodies in mammalian cells is one of key problems in im-munobiotechnology. Alternatively, expression of a broad panel of antibodies and of their fragments may be effectively done in yeast cells. We obtained expression strains of the methylotrophic yeast Pichia pastoris producing single chain human catalytic antibody A17 (A.17scFv), Fab-fragment (A.17Fab) and full-size light chain (A.17Lch). These antibodies were characterized in terms of functional activity. The capacity to specifically bind and transform organophosphorus compounds has been demonstrated for A.17scFv and A.17Fab. The loss of activity of the antibody light chain when expressed alone indicates that the active site is formed by both heavy and light chains of the antibody. We determined the reversible constant Kd and the first order constant (k2) of the reaction of the covalent modification of A.17scFv and A.17Fab by irreversible inhibitor of the serine proteases p-nitrophenyl 8-methyl-8-azobicyclo[3.2.1]phosphonate (Phosphonate Х). Calculated values indicate that activity of the antibodies expressed in yeast is similar to the full-size antibody A17 and single chain antibody A.17 expressed in CHO and E. coli cells respectively.
Keywords: catalytic antibodies, expression of recombinant antibodies, Pichia pastoris.
Эл. почта: *gabibov@gmail.com; **bobik_tanya@mail.ru
В последнее время весьма актуальной стала проблема создания биологических антидотов к фосфор-органическим токсинам (ФОТ) [1]. Востребованность антидотов к ФОТ обусловлена все возрастающим бесконтрольным применением пестицидов, особенно в странах Африки и в развивающихся странах Юго-Восточной Азии [2], опасностью техногенных катастроф и достаточно высокой вероятностью террористических атак. Низкомолекулярные антидоты на основе оксимов (пралидоксим, дипироксим и др.), применяющиеся при отравлении ФОТ, малоэффективны в случае интоксикации веществами, вызывающими быстрое "старение" холинэстеразы, основного биологического акцептора ФОТ в организме человека [3]. При этом низкомолекулярные антидоты обладают сравнительно высокой токсичностью (при внутримышечном введении мышам ЛД50 составляет 102—229 мг/кг) [4], плохо проникают через биологические мембраны, а некоторые из них, например дипироксим, в ряде случаев образуют с ФОТ трудногидролизуемые эфиры, токсичность которых выше, чем у исходных веществ [5]. Один из путей создания эффективных антидотов нового поколения состоит в получении специфических антител-акцепторов, способных ковалентно взаимодействовать или даже деградировать ФОТ. Ранее мы получили антиидиотипическое антитело к ацетилхолинэстеразе, способное специфически связывать ФОТ [6]. Альтернативным подходом к получению антидотов на основе антител может быть механизм-зависимая селекция комбинаторных библиотек иммуноглобулинов человека. Ранее в результате скрининга полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека с использованием я-нитрофенил-8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октанфенилфосфоната (фосфо-нат Х) отобрали рекомбинантное одноцепочечное антитело А. 17, ковалентно взаимодействующее с необратимыми ингибиторами сериновых гидролаз [7]. Ковалентное взаимодействие между фосфона-том Х и антителом А.17 ингибировалось предынку-бацией с ингибиторами сериновых протеаз, такими как аминоэтилбензилсульфонилфторид (АЕВ8Б) и аналоги валина и фенилаланина, карбоксильная группа которых заменена на дифенилфосфонат. В то же время предынкубация с более активными фтор-фосфонатами, такими как зарин и кумаринилэтил-я-трифторацетамидофенилметилфосфонат, не приводила к ингибированию реакции модификации антитела А.17 фосфонатом X. Эти данные свидетельствуют о специфичности активного центра, отобранного с использованием фосфоната X. Методами масс-спектрометрии SELDI установлено, что кова-лентной модификации подвергается остаток У37, расположенный во втором каркасном регионе лег-
кой цепи. Данные масс-спектрометрии подтверждены с помощью сайт-направленного мутагенеза. Замены A.17Y37F и A.17Y37S приводили к полной потере активности мутантных белков в отношении фосфоната X. Эти данные показывают, что для изучаемого антитела важно не только присутствие в положении 37 легкой цепи аминокислотного остатка, содержащего гидроксильную группу, но и расположение этой группы в активном центре. Полученное одноцепочечное антитело можно рассматривать как пример "примитивного активного центра" биокатализатора и использовать его в качестве матрицы для синтеза антитела, нейтрализующего ФОТ, целенаправленно улучшая его свойства при помощи рационального дизайна белковой молекулы. Однако система экспрессии в клетках Escherichia coli не обеспечивает процессинг, фолдинг и посттрансляционные модификации рекомбинантных белков, что приводит к снижению их стабильности при введении в кровоток животных и человека. Кроме того, многочисленные попытки создать технологию получения одноцепочечных антител в количествах, необходимых для биофармацевтического производства, с использованием системы экспрессии в E. coli не увенчались успехом [8]. В большинстве случаев антитела, предназначенные для клинического применения, нарабатывают в культуре клеток яичников китайского хомячка (линия СНО). Мы получили трансфектомы клеточных линий миело-мы NSO-bc12 и СНО, стабильно продуцирующие и секретирующие полноразмерное антитело А.17 в культуральную среду [9]. Это антитело сохранило способность ковалентно взаимодействовать с фосфонатом Х, оно обладает реакционной способностью, сходной со способностью одноцепочечного антитела. При этом, как и в случае одноцепочечно-го антитела, реакция ингибируется диизопропил-фторфосфатом (DFP), аминоэтилбензилсульфонил фторидом (AEBSF) и параоксоном. Эти ингибиторы сериновых гидролаз по механизму действия являются аналогами ФОТ, поэтому можно предположить, что антитело А.17 способно связывать сами ФОТ и служить матрицей для создания антитела-антидота с улучшенными характеристиками связывания ФОТ. Однако в случае экспрессии антител в клеточных культурах получение репертуара мутантных форм с измененной структурой гипервариабельных участков, что особенно интересно при создании новых биокатализаторов с использованием принципов рационального дизайна, представляет собой большую техническую проблему.
Система экспрессии в метилотрофных дрожжах P. pastoris в короткие сроки зарекомендовала себя как удобный, сравнительно недорогой и доступный способ получения рекомбинантных белков [10].
Культура P. pastoris не требует для своего роста многокомпонентных сред, а достигает высокой плотности при росте на минимальной среде [11, 12]. При этом она, безусловно, обеспечивает значительно более высокий уровень рекомбинантных белков, чем система экспрессии в культуре клеток млек
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.