НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 2, с. 161-165
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.352
ЭКСПРЕССИЯ НАДФН-ДИАФОРАЗЫ В МОЗГЕ КРЫС В ОТДАЛЕННЫЕ СРОКИ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ХОЛИНОТОКСИНА AF64A
© 2007 г. М. Ю. Степаничев1' *, М. Л. Либе1, И. А. Чернышевская1, А. Г. Мойсеенок2,
Н. В. Гуляева1
1 Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва 2 ГУ НПЦ Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси, Гродно, Беларусь
Введение нейротоксина этилхолина азиридиния (AF64A) избирательно приводит к возникновению необратимого холинергического дефицита в мозге. Крысам линии Вистар интрацеребровентрику-лярно билатерально вводили AF64A в разных дозах (1-3 нмоль/желудочек). Через 28 дней после инъекции токсина проводили исследование числа выживших нейронов в дорзолатеральной, промежуточной и медиальной группах клеток срединной перегородки. Установлено, что AF64A во всех исследованных дозах вызывал снижение плотности нейронов и экспрессии холинацетилтрансфера-зы (ХАТ) в указанных отделах перегородки. Срезы мозга были также окрашены на НАДФН-диа-форазу, присутствие которой может служить показателем активности нейрональной NO-синтазы в клетках. Эффект AF64A на экспрессию НАДФН-диафоразы отличался в разных отделах септум. Число НАДФН-диафораза-позитивных клеток возрастало в медиальной группе клеток, где эффект AF64A на ХАТ был менее выражен. Напротив, снижение экспрессии НАДФН-диафоразы в дорсо-латеральной группе клеток сопровождалось более выраженным снижением числа ХАТ-позитив-ных клеток. Предполагается, что условиях токсического действия AF64A NO может выполнять защитную функцию.
Ключевые слова: холинергический дефицит, AF64A, НАДФН-диафораза, нейродегенерация, оксид азота.
Введение нейротоксина этилхолина азиридиния (AF64A) избирательно приводит к возникновению необратимого холинергического дефицита в мозге экспериментальных животных. Интрацере-бровентрикулярная инъекция AF64A вызывает снижение синтеза ацетилхолина. Избирательное воздействие AF64A на холинергические клетки обусловлено взаимодействием этого нейротоксина с системой высокоафинного транспорта на мембранах этих нейронов [1]. Среди быстрых эффектов AF64A помимо нарушения системы обратного захвата холина - ингибирование холин-ацетилтрансферазы (ХАТ) [2-4], повреждение ДНК и активация свободнорадикальных процессов, что, в свою очередь, ведет к гибели нейронов [5-7]. Считают, что AF64A инициирует гибель клеток по механизму апоптоза, который не связан с активацией N-метил-В-аспартатных (NMDA) рецепторов [8]. При этом AF64A способен вызывать апоптоз нейронов в культурах независимо от природы клеток [9]. Аналогичный эффект наблюдается in vivo при использовании относительно высоких доз этого нейротоксина [10].
Одним из индукторов клеточной гибели может являться оксид азота (NO). NO - высокоактивное
*Адресат для корреспонденции: 117485, г. Москва, ул. Бутлерова, 5а, тел./факс: (495) 952-40-07; e-mail: mikhaiI_stepamchev@yahoo. com
соединение, образующееся в мозге, главным образом, в результате ферментативного окисления аргинина, которое осуществляется специализированным ферментом NO-синтазой (NOS). Хорошо известно участие NO в механизмах повреждения нервных клеток при активации NMDA рецепторов, при действии каината, хинолиновой кислоты, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина, метамфетамина, в-амилоида [см. 11]. Будучи соединением свободнорадикальной природы, NO может играть двойственную роль в мозге в условиях окислительного стресса. С одной стороны, NO может способствовать интенсификации свободнорадикальных процессов и усилению повреждения ткани, с другой - выступать в качестве агента антирадикальной защиты. Введение AF64A в боковые желудочки мозга крыс приводило к временному снижению активности NOS в гиппокампе в первые дни после инъекции с постепенным возвращением к нормальному уровню. В то же время в париетальной коре наблюдалось кратковременное увеличение активности NOS, совпадавшее по срокам с изменениями, происходившими в гиппокампе. Ингибирование NOS не специфичным в отношении разных изоформ этого фермента ингибитором L-NAME способствовало усилению холинотоксического эффекта AF64A [7, 12, 13]. Это свидетельствует о том, что
снижение активности NOS может способствовать развитию септогиппокампальной нейродегене-рации.
Приведенные выше данные свидетельствуют о важном значении модуляции активности нитр-ергической системы в механизме воздействия AF64A на мозг экспериментальных животных в ранние сроки после введения нейротоксина. В настоящем исследовании были изучены отдаленные нейродегенеративные изменения, вызванные введением AF64A. Для оценки участия NO в механизмах этих изменений использовали НАДФН-диафоразную реакцию как метод визуализации активности NOS in situ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы самцы крыс линии Wistar массой 250-350 г. Крыс содержали по пять особей в пластмассовых клетках в условиях вивария при искусственном 12-часовом световом режиме (день 8.00-20.00) и свободном доступе к воде и пище. Экспериментальный протокол утвержден Этической комиссией ИВНД и НФ РАН и соответствовал международным стандартам проведения экспериментов с животными (European Communities Council Directive (86/609/EeC)).
Для проведения операций крысы были распределены случайным образом на две группы: контроль - ложнооперированные и опыт - с введением AF64A. Крысам под кетаминовой анестезией (150 мг/кг массы тела) стереотаксически билатерально вводили AF64A в желудочки мозга по следующим координатам [14]: AP -0.8 мм от брегмы; L ± 1.5 мм; DV + 3.8 мм. Подопытным животным вводили по 1-3 нмоль AF64A (RBI, США) в искусственной спинно-мозговой жидкости (1 нмоль/мкл) в расчете на 1 желудочек; контрольным крысам вводили равный объем искусственной спинномозговой жидкости. Растворы готовили, как описано ранее [2]. Введение веществ осуществляли со скоростью 1 мкл/мин. Иглу шприца оставляли на месте инъекции в течение 3 мин.
Через 28 дней после введения токсина животных анестезировали и мозг фиксировали транс-кардиальной перфузией (50 мл гепаринизирован-ного изотонического раствора, 250 мл 4%-ного параформальдегида, приготовленного на 0.1 M фосфатном буфере, pH 7.4). Мозг вынимали и до-фиксировали в том же фиксирующем растворе в течение 24 ч. После фиксации образцы помещали в 20%-ный раствор сахарозы для криопротекции. Криостатные срезы толщиной 25 мкм помещали на желатинизированные стекла и окрашивали по Нисслю.
В ряде случаев блоки мозга, содержащие ядра перегородки, фиксировали в растворе, содержащем этиловый спирт : формалин : уксусную кис-
лоту (в объемном соотношении 7 : 2 : 1) методом погружения. Через 2 ч образцы переносили в 70%-ный этанол и хранили до исследования. После этого блоки заливали в парафин и фронтальные срезы толщиной 10 мкм окрашивали по Нис-слю толуидиновым синим.
Часть срезов гистохимически окрашивали на активность ХАТ по A. Burt и A. Silver [15] с использованием 2 мМ фенилметансульфонилфто-рида в качестве ингибитора холинэстераз.
Окрашивание на НАДФН-диафоразу (НАДФНд) проводили в реакционной среде, содержащей 122.3 мкМ нитросинего тетразолия, 1.2 мМ рНАДФН, 0.3% Triton X-100 (Serva, FRG), 0.1 М фосфатный буфер (pH 7.4). Срезы инкубировали в течение 90 мин при 37°C.
Число окрашенных по Нисслю и ХАТ-позитив-ных нейронов подсчитывали в объеме 18 х 104 мкм3 (дорзо-латеральная (LSD) и промежуточная (LSI) группы клеток перегородки) или 9 х 104 мкм3 (медиальная группа клеток (MS) перегородки). Число НАДфНд-позитивных нейронов подсчитывали в объеме 25 х 104 мкм3. Полученные данные обрабатывали статистически с применением непараметрических методов анализа.
В работе использовали реактивы компании Sigma (США) за исключением специально оговоренных случаев.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Число клеток в ядрах перегородки подсчитывали через 28 дней после введения 1, 1.5 или 3 нмоль AF64A/желудочек. Введение нейротоксина вызывало заметные нейродегенеративные изменения в ядрах перегородки. На микрофотографиях, представленных на рис. 1 (А,Б), видно выраженное снижение плотности клеток в LSD крыс после введения 3 нмоль AF64A. Анализ числа нейронов в разных ядрах перегородки показал (рис. 1В), что AF64A вызывал достоверное снижение в LSD (H(1, 8) = 4.0; p < 0.05 Kruskal-Wallis ANOVA), LSI (H(1, 8) = 4.0; p < 0.05) и MS (H(1, 8) = = 4.4; p < 0.04). В то же время нам не удалось выявить четкой зависимости гибели нейронов в LSI от использованной дозы AF64A (H(3, 8) = 4.5; p = = 0.2), тогда как в LSD и MS имела место тенденция дозозависимого снижения числа нейронов (H(3, 8) = 6.7; p = 0.08 и H(3, 10) = 7.1; p = 0.07 соответственно).
Будучи по своей природе структурным аналогом холина, AF64A действует, прежде всего, на холинергические нейроны. Для анализа числа хо-линергических нейронов, сохранившихся после воздействия токсина, срезы мозга были окрашены гистохимически на присутствие активной ХАТ. Было установлено (рис. 2), что введение AF64A
Число клеток
100
80
60
40
20
В
Контроль i i AF64A (1 нмоль) i i AF64A (1.5 нмоль) I-1 AF64A (3 нмоль)
MS
* ^ **
Т1
LSI
LSD
Рис. 1. Нейродегенеративные изменения в мозге крыс, вызванные введением AF64A. Представлены микрофотографии срезов мозга крыс (дорзолате-ральная группа клеток перегородки), полученные через 28 дней после введения искусственной спинномозговой жидкости (А) или 3 нмоль AF64A (Б). В -число выживших нейронов (M ± S.E.M.) после воздействия различных доз AF64A в медиальной (MS), промежуточной (LSI) и дорзолатеральной (LSD) группах клеток перегородки. * - достоверные отличия от животных контрольной группыp < 0.05 по непараметрическому критерию Манна-Уитни. Окраска по Нис-слю, шкала - 100 мкм.
Число 70
60 50 40 30 20 10 0
В
ХАТ-позитивных нейронов
ш Контроль i AF64A (1 нмоль) i AF64A (1.5 нмоль) i AF64A (3 нмоль)
ш
MS LSI LSD
Рис. 2. Влияние AF64A на активность холинацетил-трансферазы в мозге крыс. Представлены микрофотографии срезов мозга крыс (медиальная группа клеток перегородки), полученные через 28 дней после введения искусственной спинно-мозговой жидкости (А) или 3 нмо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.