ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 5, с. 744-754
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ЭКСПРЕССИЯ НЕКОТОРЫХ кДНК В КОРНЯХ ПШЕНИЦЫ
В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ
© 2007 г. Д. Г. Ли*, Ч. С. Чжан*, Д. Ю. Ким*, Р. Ч. Сонг*, И. Г. Ким*, Д. С. Ким**, Ё. В. Со*
*Факулътет биотехнологии, Колледж естественных наук и биотехнологии, Сеул, Корея **Научно-исследователъский институт атомной энергетики, Дежон, Корея
Поступила в редакцию 26.09.2006 г.
Гипоксия, возникающая при затоплении полей, негативно сказывается на урожайности сельскохозяйственных культур во многих странах мира. Для изучения процессов в корнях пшеницы (Triticum aestivum L.) при гипоксии на уровне транскрипции мы создали библиотеку кДНК растений пшеницы, выращенных в условиях контролируемого гипоксического стресса. Из полученных 1344 последовательностей 1274 имели длину не менее 50 п.н. Их мы сгруппировали в 879 наборов неперекрывающихся последовательностей при помощи программы Phrap. Их сравнение с базой данных несокращенных последовательностей при помощи программы BLASTx показало, что 494 последовательности имеют высокую гомологию с известными аминокислотными последовательностями растений (E < e-10). Сто двенадцать клонов не имели гомологии ни с какими последовательностями EST (от Expressed Sequence Tag) пшеницы в базе данных. Для 118 клонов мы оценили уровень их транскрипции в условиях гипоксии и провели их функциональную классификацию по ген-онтологической системе. Полученные нами результаты могут быть полезным источником информации для дальнейших исследований реакции корней пшеницы на затопление.
Triticum aestivum - короткая экспрессируемая последовательность ДНК - гипоксия - корни
ВВЕДЕНИЕ
Затопление возникает, когда дождевые, талые или поднявшиеся грунтовые воды в течение долгого времени остаются на поверхности почвы или в подпочвенном слое. Затопления часто происходят во многих регионах мира и отрицательно влияют на урожай пшеницы. Оценивается, что затопления происходят примерно на 10% всей площади суши планеты [1]. Ежегодно 10-15 млн. га мировых посевов пшеницы страдают от затоплений [2], что составляет 15-20% от 70 млн. га пахотных земель, занятых под выращивание данной культуры [3].
Затопленные растения подвержены целому ряду стрессов, включая затрудненный газообмен и нехватку питательных веществ. Одним из наи-
Сокращения: EST - короткая экспрессируемая последовательность ДНК (от Expressed Sequence Tag); ПДК - пируват-декарбоксилаза; ГО - генетическая онтология; ПЦР - поли-меразная цепная реакция.
Адрес для корреспонденции: T. G. Lee. Division of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, Anam-Dong, Seongbuk-Gu, Seoul, 136-713 Korea. Fax: +82-2-3290-3501; e-mail: seoag@korea.ac.kr
более критических факторов стресса является нехватка кислорода (гипоксия или аноксия), а изменение концентрации газов в почве, в том числе кислорода - первое химическое воздействие, с которым сталкивается растение [4]. Очевидными негативными эффектами воздействия затопления являются замедление развития семян и листьев, нарушения и/или прекращение роста листьев и корней и хлороз листьев, приводящие в итоге к снижению урожайности пшеницы. Чтобы выжить в подобных условиях, растения выработали различные ответные механизмы, такие как альтернативные ферментативные циклы, восстановление после аноксического шока и предупреждение его последствий, а также морфологические изменения: образование аэренхимы в побегах и корнях, лигни-фикация отдельных частей корней [3].
Рядом исследователей с помощью молекуляр-но-биологических методов были определены анаэробные белки, образующиеся в растениях в условиях затопления [5], и выявлены некоторые особенности физиологии растений в анаэробных условиях [6]. Для исследования экспрессии ключевых генов и метаболических механизмов, работающих в условиях затопления, использовали мно-
гие сельскохозяйственно-значимые культуры, такие как кукуруза (часто использовалась для исследования метаболизма в корнях в условиях гипоксии и аноксии), рис (растет на увлажненной почве), хлопок (очень чувствителен к переувлажнению) [5, 7, 8]. Несмотря на то, что определено много генов и ферментов, участвующих в клеточном метаболизме, имеется очень мало информации о том, как именно растения чувствуют переувлажнение и какие цепи передачи сигналов работают в условиях затопления. Понимание ряда функций растения, а именно, того, как проходит определение концентрации кислорода в области корней и какие физиологические и метаболические изменения проходят в растении в ответ на затопление, и было главной целью нашего исследования. В гликолизе и ферментативных циклах, дающих растению энергию в условиях нехватки кислорода, принимают активное участие алко-гольдегидрогеназа, энолаза, пируватдекарбокси-лаза (ПДК) и еще не менее 20 белков. Большой интерес для исследования представляют также метаболизм в корнях и морфологические изменения в растении в условиях затопления, такие как образование аэренхимы и лигнификация частей корней.
Важным этапом на пути к созданию генетического пула образцов растений, испытывающих тот или иной вид стресса, является построение библиотек кДНК [7, 9]. Короткие экспрессируе-мые последовательности ДНК (EST от Expressed Sequence Tag) часто являются первым типом генетического материала, который становится доступным исследователям. На основе этого материала получают информацию о генах, кодируемых данными последовательностями. В последнее время многие исследователи определили последовательности EST различных тканей растений, а стремительное развитие баз данных ДНК сделало возможным быструю классификацию клонов EST. В частности, этому очень способствовало определение последовательностей EST в тканях корней растений [10-12] в нормальных условиях и в условиях стресса, вызванного нехваткой кислорода [13].
В нашем исследовании мы провели анализ коротких последовательностей библиотеки кДНК, созданной из материала корней растений пшеницы, испытывающих гипоксический стресс, и в которых вследствие этого повышалась экспрессия пДк и образовывалась аэренхима. Мы провели дифференциальную гибридизацию и денситомет-рический анализ 118 клонов и классифицировали их по причастности к поддержанию структуры клеточной стенки, метаболизму, мембранному транспорту и передаче сигнала. Функциональную классификацию клонов дифференциальной гибридизации провели также по их генетической онтологии (ГО).
МЕТОДИКА
Растительный материал и условия гипоксии.
Растения пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Geumgangmill, выведенный Корейским национальным институтом зерновых) выращивали в контейнерах размером 12 х 45 х 27 см (высота х х длина х ширина) с песком в теплице при естественном освещении. Поверхность песка поливали жидким удобрением HYPONEX (соотношение питательных веществ N : P : K = 5 : 10 : 5) в соответствии с рекомендациями поставщика. Средняя длительность светового дня составляла 10 ч, а средний температурный режим был 20°C днем и 10°C ночью. После завершения роста третьего листа часть растений переносили в 4-литровый пластмассовый контейнер размером 3.6 х 41 х 32 см (высота х длина х ширина), наполненный 0.1%-ным раствором агара для создания условий затопления, как описано Wiengweera с соавт. [14], с небольшими изменениями. Каждое растение закрепляли в отверстии диаметром 1.3 см при помощи ваты, а поверх нее наклеивали пленку. В каждый контейнер помещали 70 растений и накрывали его крышкой. Температуру питательного раствора агара (с добавлением В5 среды [15]) поддерживали равной 19-22°C. Контрольные растения выращивали в тех же условиях, что и опытные до начала обработки. Концентрацию кислорода в растворе агара измеряли, как было описано ранее [16].
Экспрессия пируватдекарбоксилазы в условиях гипоксии. Для выделения РНК собирали корни и нижнюю часть побега растений до 1 см выше семядольного узла через 0, 2, 4. 6 и 8 дней после начала гипоксической обработки (ДПО). Образцы собирали в одно и то же время дня. Процедуру но-зерн-гибридизации проводили, как это подробно описано в [17]. РНК наносили в количестве 10 мкг на лунку, разделяли в агарозном геле, содержавшем формальдегид, и переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану. ПДК (КФ 4.1.1.1) метили биотином с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) на приборе "InVitrogen".
Анатомия корней в условиях гипоксии. При
помощи ручного микротома Finesse 325 ("Thermo Shandon", США) получали поперечные срезы придаточных корней опытных (подвергнутых гипоксии) и контрольных растений и окрашивали их 0.1%-ным анилиновым красителем. Срезы фотографировали при помощи микроскопа Axiosk-op 2 Plus ("Carl Zeiss", Германия).
Построение библиотеки кДНК и анализ EST.
Из корней и нижних частей подвергнутых гипоксии растений выделяли суммарную РНК. Для этого брали смесь образцов весом 40 мкг, взятых у растений спустя 0.5, 1, 2, 4, 6, и 8 ДПО. Образцы собирали в одно и то же время дня. Построение
библиотеки кДНК и анализ EST проводили, как описано в работе [18]. Первичную обработку данных проводили с помощью программного обеспечения PHRED/PHRAP. Всего мы поместили в Ген-банк 1274 последовательности (коды доступа DN828708-DN829789 и DN948989-DN949180) высокой степени достоверности и длиной не менее 50 п.н. каждая. Каждую реконструированную последовательность проверяли по базе несокращенных последовательностей NCBI при помощи программы BLASTx, а также при помощи программы BLASTn на гомологию с последовательностями EST пшеницы. Гомологию считали значительной, если величина E составляла менее, чем e-10 по BLASTx, и менее, чем e-25 по BLASTn, соответственно.
Дифференциальная гибридизация 118 клонов.
Из 1274 полученных клонов были отобраны 118 клонов, связанных со структурой клеточной стенки, метаболизмом, мембранным транспортом и передачей сигналов. Отобранные клоны в равных количествах (по 600 нг) кипятили в течение 10 мин в растворе, содержавшем 0.4 М NaOH и 10 мМ ЭДТА, после чего переносили на 2 положительно заряженные нейлоновые мембраны для дот-гибридизации под вакуумом на 96-доро-жечном
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.