научная статья по теме ЭКСПРЕССИЯ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ СЕМЕЙСТВ MAGEA И MAGEB В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТАХ МЫШИ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ IN VITRO Биология

Текст научной статьи на тему «ЭКСПРЕССИЯ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ СЕМЕЙСТВ MAGEA И MAGEB В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТАХ МЫШИ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ IN VITRO»

ОНТОГЕНЕЗ, 2015, том 46, № 3, с. 186-197

= ЭМБРИОГЕНЕЗ И КАНЦЕРОГЕНЕЗ

УДК 611-013;57.086.835;577.218

ЭКСПРЕССИЯ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ СЕМЕЙСТВ MAGEA И MAGEB В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТАХ МЫШИ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ IN VITRO

© 2015 г. О. Ф. Гордеева

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26

e-mail: olgagordeeva@yandex.ru Поступила в редакцию 24.11.2014 г.

Окончательный вариант получен 30.12.2014 г.

Раково-тестикулярные антигены экспрессируются в сперматогенных и раковых клетках, а также в плюрипотентных стволовых клетках мыши и человека. Однако роль раково-тестикулярных антигенов семейств Mage в регуляции клеточных процессов в эмбриональных клетках практически не известна. В представленной работе был проведен сравнительный количественный анализ экспрессии генов семейств Magea и Mageb в эмбриональных соматических клетках мыши (эмбриональных фиб-робластах мыши, МЭФ), длительно культивируемых in vitro или подвергшихся воздействиям факторов, ингибирующих и стимулирующих пролиферацию. Проведенный анализ выявил низкую экспрессию раково-тестикулярных антигенов семейств Mage в МЭФ и показал, что снижение проли-феративной активности МЭФ в ходе культивирования на поздних пассажах сопровождается незначительным возрастанием уровней экспрессии генов семейств Magea и снижением уровней экспрессии генов семейства Mageb. Однако при модуляции активности MEK/ERK-сигнального пути и обработке деметилирующим агентом 5-азацитидином экспрессия генов семейств Magea и Mageb в МЭФ практически не изменялась. Наибольшие изменения уровней экспрессии генов семейств Magea и Mageb были выявлены только при воздействии митомицина С. Во всех экспериментальных вариантах была выявлена преимущественная цитоплазматическая локализация белков семейств Mage как в клетках на стадии синтеза ДНК, так и на других стадиях клеточного цикла. Предположительно, в активно пролиферирующих эмбриональных соматических клетках мыши антигены семейств Magea и Mageb могут выступать в роли ко-активаторов регуляции пролиферации и других клеточных процессов.

Ключевые слова: раково-тестикулярные антигены, маланомные антигены, Ма§еа, Ма§еЪ, С-тус, пролиферация, МЕК/ЕКК, эмбриональные фибробласты мыши.

DOI: 10.7868/S0475145015030039

ВВЕДЕНИЕ

Функции раково-тестикулярных антигенов (РТА), включающих более 100 генов у человека, до сих пор остаются неизвестными. Специфические паттерны экспрессии РТА млекопитающих в норме ограничены только сперматогенными клетками, эмбриональными и внезародышевыми клетками, но аберрантные паттерны экспрессии обнаружены в большинстве опухолевых клеток различного происхождения. Как и у человека, в геноме мышей были идентифицированы 18 генов семейств Mage, восемь из которых были гомологичны генам семейств MAGE-A (Melanoma Antigen A) человека, пять — генам MAGE-B, два — MAGE-D, два - MAGE-E и один - MAGE-L. Большинство генов семейств Magea и Mageb (за исключением Mag-b3) в геномах мыши и человека

локализованы на Х-хромосоме, (De Backer et al., 1995; De Plaen et al., 1999; Ohman Forslund et al., 2001; Osterlund et al., 2000). Нуклеотидные и белковые последовательности генов семейств Mage имеют высокую гомологию между членами семейства (83—99% и 65—98% соответственно для Magea), тогда как гомология между членами семейств Magea и Mageb составляет около 35—40% (De Plaen et al., 1999). Нуклеотидные последовательности генов Mageb1 и Mageb2 имеют 99% гомологию и кодируют идентичные белки, поэтому они часто обозначаются Mageb1/2. Структура гена Mageb3 указывает на то, что он может являться аутосомным псевдогеном, который в отличие от других членов семейства локализуется на 3-й хромосоме.

Несмотря на то, что РТА у млекопитающих были идентифицированы более 20 лет назад, мало известно об их свойствах и роли в регуляции различных процессов (Sang et al., 2011). Предшествующие исследования показали, что РТА вовлечены в регуляцию транскрипции генов (Laduron et al., 2004), пролиферативной активности (Jung-bluth et al., 2005; Nagao et al., 2003; Ohman Forslund et al., 2001; Por et al., 2010), апоптоза (Marcar et al.,

2010) и чувствительности раковых клеток к цито-кинам (Park et al., 2002). Кроме того, было обнаружено, что РТА могут быть вовлечены в детерминацию и специализацию эмбриональных клеточных линий. Так было установлено, что гены MAGE-A и GAGE специфически экспрессируются в развитии мужских и женских половых клеток у человека (Aubry et al., 2001; De Plaen et al., 1999; Gaskell et al., 2004; Gjerstorffet al., 2006; Gjerstorffet al., 2007). Экспрессия генов семейств MAGE/Mage выявлена в плюрипотентных стволовых клетках мыши и человека, а также в развивающихся нейроэктодер-мальных и мезодермальных клетках и клетках плаценты у человека (Andrieu et al., 2003; Deponti et al., 2007; Gjerstorff et al., 2008; Jungbluth et al., 2007; Kuwajima et al., 2006; Lifantseva et al., 2011).

Экспрессия РТА семейств Mage была в основном исследована в различных раковых клетках in vitro или в клинических образцах опухолей разного происхождения (Sahin et al., 2000; Yuasa et al., 2001). Однако практически отсутствуют данные об их экспрессии в нормальных клетках, длительно поддерживаемых в культуре in vitro (Cronwright et al., 2005; Gjerstorff et al., 2008; Lifantseva et al.,

2011). В нашей предыдущей работе мы предположили, что экспрессия РТА семейств Mage может быть ассоциирована с развитием ранних эмбриональных линий, тогда как их аберрантная экспрессия — с патологическими процессами, в частности, с трансформацией и канцерогенезом (Lifantseva et al., 2011). В связи с этим, в представленной работе был проведен сравнительный анализ экспрессии генов семейств Magea и Mageb в эмбриональных соматических клетках мыши (эмбриональных фибробластах мыши, МЭФ), длительно культивируемых in vitro или подвергшихся воздействиям факторов, ингибирующих и стимулирующих пролиферацию, для изучения их роли в регуляции клеточных функций.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Культивирование клеток. В работе были использованы эмбриональные фибробласты мыши (МЭФ), полученные из эмбриональной мезенхимы зародышей мышей линии C57Bl/6 на стадии Е13.5. Мыши линии C57Bl/6 были получены из питомника лабораторных животных "Пущино" ФИБХ РАН (Пущино, Московская область). Содержание животных и экспериментальные про-

цедуры проводили в соответствии с рекомендациями биоэтического комитета ИБР РАН.

МЭФ культивировали в течение семи пассажей в среде DMEM, содержащей 1мМ L-глутами-на, 0.1 мМ заменимых аминокислот и 15% фе-тальной сыворотки коров ("HyClone", США). Пассирование МЭФ проводили через каждые 72 ч с использованием 0.05%-го раствора трипсин—ЭДТА для диссоциации клеточных культур ("HyClone", США). В работе были использованы МЭФ на 1-, 3-, 5- и 7-м пассажах. Для анализа клеточного роста и времени удвоения популяции МЭФ на указанных пассажах высевали в 6-луночные планшеты (Geinerbio, Германия) с плотностью 5 тыс. клеток /см2 и затем подсчитывали число клеток после культивирования в течение 72 ч.

Экспериментальные воздействия. Для изучения вовлеченности раково-тестикулярных антигенов семейств Magea и Mageb в регуляцию пролиферации МЭФ подвергали воздействиям ингибиторов и стимуляторов пролиферации: цитостатика ми-томицина С (10 мкг/мл) и синтетического ингибитора киназы MEK1 (MEK/ERK-сигнального пути) PD98059 (25 мкМ) (все "Sigma", США), а также фактора роста фибробластов человека (human fibroblast growth factor, FGF2, 100 нг/мл, "PanBioTech", Германия). Для анализа эпигенетической регуляции экспрессии антигенов семейств Magea и Mageb МЭФ обрабатывали деметилирую-щим агентом 5-азацитидином (5-Azacytidine,

I мкМ, "Sigma", США). Для экспериментов МЭФ на 3-м пассаже высевали в 6-луночные планшеты (Geinerbio, Германия) с плотностью 10 тыс. кле-ток/см2 и культивировали в среде с фетальной сывороткой в течение ночи для их полной адгезии и адаптации. На следующий день производили смену среды, содержащей 15% заменителя фетальной сыворотки (Knockout Serum Replacement, "Gib-co", США), добавляли перечисленные вещества и культивировали в течение 24 ч. Для иммуногисто-химического анализа и анализа пролиферативной активности МЭФ высевали с той же плотностью в 8-луночные планшеты на стекле (Lab-Tek

II Chamber Slide System; Nalge Nunc International, США) и проводили экспериментальные воздействия по описанному выше протоколу.

Выявление пролиферирующих клеток на стадии синтеза ДНК. После завершения экспериментальных воздействий МЭФ культивировали в среде с 10мкМ этинил-дезоксиуридина (EdU, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine, Click-iT® EdU Imaging Kit, " Molecular Probes", США) в течение 1 ч. Выявление клеток, меченных EdU, проводили в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. В основе метода Click-iT® EdU для выявления клеток в S-фазе клеточного цикла лежит реакция между алкином в EdU и азидом флуоресцентного красителя Alexa Fluor®, катализируемая ионами меди. Продукты этой реакции реги-

Структура праймеров для РВ-ПЦР-анализа экспрессии генов семейств Magea, Mageb и C-myc мыши

Ген № последовательности в GeneBank Прямой и обратный праймеры Размер ПЦР последов., п.о.

Magea2 NM_020016 5'atcgtatctggagactttgtggac3' 5'gggacctaaactggcactgc3' 92

Magea4 NM_020280 5 'tcggagccaaagggagttag3' 5'tgcacagtgggtcttcctgt3' 224

Magea6 NM_020019 5 'aaggcttggatcttgagcaga3' 5'ccaccacccagctctcaaata3' 131

Magea8 NM_020020 5'ccagttgagatatagaggctgaacc3' 5'atggcaaggcaaggcgaa3' 104

Magea1—8 NM_020015

NM_020016 5'cctctgagtgcttgaagatggt3' 83

NM_020017 5 'ggcagtgacaaggatataggagtg3'

NM_020280

NM_020018

NM_020019

NM_020020

Magebl NM_010759 5'aggtctccattaagtccaaggtattc3' 5'ggaatctggaaggataagaatgacaac3' 82

Mageb3 NM_008545 5'cctgttgcccttggacctatg3' 5'gcgtttcagcatcaagaagattaag3' 168

Mageb4 NM_001033492 5 'gggaatttcgcttagcaatcaagg3' 5'gtggcaagagacagcagatagg3' 159

Mageb5 NM_028847 5'ggagaatcatccacttctgaagag3' 5'ggttgcggtggtgcttattc3' 86

Magebl—3 NM_010759 NM_031171 NM_008545 5'cagtcacgcagggaggttc3' 5 'caggcaggacagcagcatt3' 193

C-myc NM_001177352 5'tgatgtggtgtctgtggagaaga3' 5'g

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»