УДК 577.34
ЭКСПРЕССИЯ СИГНАЛЬНЫХ И НЕЙРОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ В ПЕНУМБРЕ ВОКРУГ ЯДРА ФОТОТРОМБОТИЧЕСКОГО ИНФАРКТА В КОРЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫСЫ
© 2015 С.В. Демьяненко1, С.Н. Панченко2, А.Б. Узденский1*
1 Южный федеральный университет, Академия биологии и биотехнологии, 344090 Ростов-на-Дону; электронная почта: auzd@yandex.ru
2 Ростовский государственный медицинский университет, 344022 Ростов-на-Дону
Поступила в редакцию 12.01.15 После доработки 11.03.15
Фотодинамическое воздействие на кору мозга животных с использованием водорастворимого фотосенсибилизатора бенгальского розового, не пересекающего гематоэнцефалический барьер, приводит к агрегации тромбоцитов, закупорке мелких сосудов и локальному инфаркту. Необратимые повреждения клеток в ядре инфаркта распространяются на окружающие ткани. Формируется переходная зона, называемая пенумброй. Быстрый некроз ткани в ядре инфаркта невозможно предотвратить, но можно ограничить более медленное распространение повреждения и защитить клетки пенумбры. Мы изучали изменения морфологии ткани и профиля экспрессии белка в пенумбре. Морфологическое исследование (стандартное окрашивание гематоксилин-эозином) показало, что в коре мозга крыс через 1 ч после фотодинамического воздействия 3 мм ядро инфаркта было окружено пенумброй шириной 1,5—2 мм, где изменения нейронов (гипо- или гиперхро-мия, пикноз) были ниже, чем в ядре. Протеомное исследование 224 нейрональных и сигнальных белков с помощью микрочипов Panorama Antibody Microarray — Neurobiology («Sigma-Aldrich», США) выявило в ткани пенумбры повышенную экспрессию белков, участвующих в поддержании целостности и навигации нейритов (NAV3, MAP1, CRMP2, PMP22); осуществляющих межклеточные взаимодействия (#-кадгерин) и си-наптическую передачу (глутаматдекарбоксилаза, триптофангидроксилаза, Munc-18-1 и Munc-18-3, syn-phylin-1); контроль качества митохондрий и митофагию (PINK1, Parkin); убиквитин-опосредованный проте-олиз (UCHL1, PINK1, Parkin, synphylin-1), а также сигнальных белков (PKBa, ERK5) по сравнению с контрольной корой в контралатеральном полушарии. Эти процессы были направлены на поддержание выживаемости и восстановление тканей. Снижение уровня протеинкиназы С, ее изоформ PKCß1/2, а также белка TDP-43 может быть направлено на снижение повреждения ткани. Некоторые из этих белков могут потенциально служить маркерами нейропротекции и нейродегенерации, а также потенциальными мишенями для фармакологического воздействия на поврежденные ткани пенумбры.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: инсульт, нейродегенерация, пенумбра, протеомика.
Ишемический инсульт — один из основных факторов инвалидности и смерти людей. Фокальная ишемия, вызванная закупоркой кровеносных сосудов, очень быстро (за несколько мин) приводит к истощению АТФ, генерации активных форм кислорода, повреждению кле-
точных мембран, потере ионных градиентов, деполяризации, эксайтотоксичности, смерти клеток и отеку тканей. Эти повреждающие процессы распространяются из ядра инфаркта и вызывают гибель клеток в прилегающей переходной области (пенумбре) [1, 2]. В ядре инфаркта
Принятые сокращения: CRMP2 — collapsin response mediator protein 2 (белок-медиатор ответа на коллапсин 2); DYRK1A — dual-specificity tyrosine-phosphorylated regulated kinase 1A (киназа двойной специфичности 1A); ERK5 — extracellular regulated kinase 2 (внеклеточно регулируемая киназа 2); GABA — y-butiric acid (у-аминомасляная кислота); MAP1 — microtubule-associated protein 1 (связанный с микротрубочками белок 1); NAV3 — neuron navigator 3 protein (навигатор нейронов 3); PINK1 — PTEN-induced mitochondrial protein kinase (PTEN-индуцированная митохондриальная протеинкиназа); PKBa — protein kinase Ba (протеинкиназа Ba); PKC — protein kinase C (протеинкиназа С); PKCß1 — protein kinase C isoform ß1 (изоформа ß1 протеинкиназы С); PMP22 — peripheral myelin protein 22 (периферический белок миелина 22); PTI — pho-totrombotic infarction (фототромботический инфаркт); SIRT1 — NAD+-dependent deacetylase sirtuin-1 (NAD+^ависимая де-ацетилаза сиртуин 1); TDP-43 — transactivation response DNA-binding protein (ДНК-связывающийся белок, реагирующий на трансактивацию генов); UCHL1 — ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (С-терминальная убиквитингидролаза L1).
* Адресат для корреспонденции.
12
937
практически невозможно спасти нервные клетки от острого некроза, но в пенумбре повреждение ткани развивается медленнее, в течение нескольких часов и дней, и это «терапевтическое окно» дает время для защиты клеток и уменьшения нейропатологических последствий [1—3]. Однако большинство имеющихся нейропротек-торных препаратов пока не эффективно. Так, детальные клинические исследования церебро-лизина, на который возлагали большие надежды, не выявили достоверной разницы в летальности пациентов и наличии у них побочных эффектов между применением этого препарата и плацебо [4]. Поэтому для разработки новых подходов к лечению последствий инсульта необходимо всестороннее исследование биохимических механизмов, регулирующих нейродегенера-цию в пенумбре, и поиск новых нейропротекто-ров.
Среди экспериментальных моделей ишеми-ческого инсульта наиболее популярна окклюзия среднемозговой артерии путем перевязки или введения нейлоновой нити с силиконовым покрытием. Тромботическая окклюзия создается с помощью инъекции тромбов или тромбина. Но при этом не всегда получается контролируемый и хорошо воспроизводимый локальный инфаркт мозга. Это оказалось возможным на основе фотодинамического эффекта и локального лазерного облучения [5—11].
При фотодинамическом воздействии на окрашенные клетки, возбужденные светом молекулы красителя-фотосенсибилизатора передают энергию кислороду и переводят его в высокотоксичную синглетную форму. Синглетный кислород и другие активные формы кислорода вызывают окислительный стресс и смерть клеток. Основанная на этом эффекте фотодинамическая терапия применяется в онкологии для разрушения опухолей [12]. Фотодинамическая индукция локального тромбоза в мозге животных — нетрадиционное применение фотодинамического эффекта. В этом методе локальное лазерное облучение мозга животных после введения водорастворимого фотосенсибилизатора бенгальского розового, который не пересекает гематоэнцефалический барьер и остается в кровеносном русле, приводит к фотосенсибилизи-рованному окислительному повреждению эндотелия и базальной мембраны, агрегации тромбоцитов и окклюзии мелких сосудов. Это быстро, за минуты, вызывает локальный фототром-ботический инфаркт мозговой ткани (ФТИ). Достоинства ФТИ как модели инсульта включают малую инвазивность воздействия, контроль расположения, размера и степени повреждения, хорошую воспроизводимость [5—11]. Микроин-
фаркт с закупоркой мелких сосудов вызывает когнитивные нарушения, деменцию и другие неврологические расстройства. Механизмы реакции нервной ткани на ишемическое повреждение и ее восстановление после микроинфаркта, в частности, участие в этих процессах различных нейроспецифических и сигнальных белков изучены пока недостаточно [13—15].
Современные протеомные методы обеспечивают информацию об экспрессии сотен белков в биологических тканях [16—19]. Для характеристики изменений уровня различных нейрональ-ных и сигнальных белков в полутени после очагового фототромботического инфаркта в участке сенсомоторной коре головного мозга крысы мы использовали протеомные микрочипы, позволяющие одновременно изучить изменения экспрессии 224 сигнальных и нейрональных белков по сравнению с симметричным контрольным участком в контралатеральной коре.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проведены на взрослых самцах крыс Вистар (200—250 г), содержащихся при температуре 22—26° с 12-часовым световым днем, при вентиляции порядка 18 смен воздуха в час. Животных содержали в соответствии с принятым в институте протоколом. Опыты проведены согласно этическим нормам и правилам проведения экспериментов над животными Европейского Союза (86/609/ЕЕС).
Односторонний фототромботический инфаркт соматосенсорной коры крыс вызывали по модифицированному методу [7]. Крыс анестезировали с помощью внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (300 мг/кг), растворенного в физиологическом растворе. После продольного разреза кожи головы удаляли надкостницу. Бенгальский розовый («Sigma-Aldrich», США), растворенный в физиологическом растворе, вводили в подключичную вену в дозировке 20 мг/кг. После введения красителя крыс фиксировали в стереотаксической установке и через черепную кость проводили одностороннее лазерное облучение соматосенсорной коры (поля FL-forelimb sensorimotor cortex, HL — hindlimb sensorimotor cortex и Par1 — parietal primary somatosensory cortex [20]). Параметры облучения: длина волны 532 нм, интенсивность 64 мВт/см2, диаметр луча 3 мм, длительность 30 мин. Температуру тела поддерживали на уровне 36,7—37,5°.
Через 1 ч после лазерного облучения животных умерщвляли повышенной дозой хлоралгидрата (600 мг/кг) и декапитацией. Визуализацию ядра инфаркта и пенумбры осуществляли с по-
мощью 15-минутного окрашивания коры мозга 1%-ным раствором хлорида трифенилтетразо-лия («Sigma-Aldrich», США) при 37°. Для гистологического исследования крыс транскардиально перфузировали 10%-ным забуференным формалином, pH 7,2, при хлоралгидратной анестезии через 1 ч после облучения. Затем мозг извлекали и постфиксировали формалином. Кусочки коры, включающие облученный участок, пенумбру и окружающую ткань заключали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 6—8 мкм монтировали на предметные стекла, депарафинировали, окрашивали гематоксилином и эозином, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, просветляли ксилолом, заключали в канадский бальзам по стандартным гистологическим методикам и исследовали под микроскопом. Все наблюдавшиеся крупные пирамидные нейроны делили на следующие категории: нормальные, обратимо измененные (гиперхромные или ги-похромные) и пикнотические (табл. 1). Их количества подсчитывали с помощью окулярной решетки на трех срезах у 4-х крыс в шести рандомизированных областях при 400-кратном увеличении микроскопа в облученном полушарии (опыт) и необлученном контра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.