ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 571-578
УДК 581.19+581.135
ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫЕ ПОЛИМЕРЫ В КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУРАХ Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn. С РАЗНОЙ МОРФОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ: ДИНАМИКА В ХОДЕ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ЦИКЛА
© 2004 г. Н. И. Румянцева, А. Н. Акулов, А. Р. Мухитов
Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ, Казань, 420111; e-mail: rumyantseva@mail.knc.ru Поступила в редакцию 21.01.2004 г.
Изучена динамика содержания экстраклеточных полимеров (ЭКП) в среде культивирования мор-фогенного (МК) и неморфогенного (НК) каллусов гречихи татарской Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn. в ходе культурального цикла. Выявлено, что МК секретировал в среду культивирования значительно больше ЭКП по сравнению с НК. В ходе пассажа в МК наблюдалось два выброса ЭКП, которые предшествовали формированию новых проэмбриональных клеточных комплексов (ПЭКК). Предполагается, что секретируемые молекулы могут участвовать в циклической реини-циации ПЭКК в МК. В НК максимальное содержание ЭКП наблюдалось к концу стационарной фазы роста культуры, что, вероятно, связано с изменением состава клеточных стенок при старении каллуса.
Культивируемые клетки растений выделяют в питательную среду большое количество разнообразных соединений, многие из которых являются жизненно необходимыми для пролиферации клеток и сохранения их регенерационной способности. Установлено, что активация деления в суспензионных культурах при пересеве на новую среду зависит от плотности культуры: чем ниже начальная плотность, тем продолжительнее лаг-фаза [1], а культивирование клеток при низкой плотности вызывает апоптоз [2]. Напротив, добавление кондиционированной среды позволяет клеткам пролиферировать и при низкой плотности культивирования [3-5]. Следовательно, в кондиционированной среде накапливаются определенные факторы, которые поддерживают жизнеспособность клеток. Ни один из известных до сих пор гормонов не способен заменить собой кондиционированную среду. Факторы кондиционирования объединяют широкий класс разнообразных соединений, к которым относятся арабиногалакта-новые белки [6, 7], липохитоолигосахариды [8], олигосахариды [9], пептиды [10, 11]. Установлено, что факторы кондиционирования могут оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее действие на эмбриогенный потенциал и развитие соматических зародышей in vitro [7, 12-14]. В связи с этим питательная среда может рассматриваться как экстраклеточный компартмент клетки, а динамика экстраклеточных молекул как важная составляющая общего метаболизма культуры. Сравнительное исследование динамики экстраклеточных молекул, секретируемых культурами с разным морфогенным потенциалом, может быть одним из подходов для
выявления факторов кондиционирования, регулирующих морфогенетическую активность клеток. Ранее нами было показано [15], что морфо-генный каллус гречихи татарской Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn., полученный из незрелого зародыша, выделяет в среду культивирования больше белков и полисахаридов, чем неморфогенный каллус, который был отселектирован из морфоген-ной культуры как рыхлый быстро нарастающий клон. Рост рыхлого неморфогенного каллуса, состоящего, главным образом, из паренхимных клеток, осуществляется за счет деления и последующего растяжения клеток [16]. Напротив, поддержание нодулярного морфотипа в эмбриогенных каллусах гречихи татарской реализуется через повторные циклы, состоящие из разрыхленных предсуществующих проэмбриональных клеточных комплексов (ПЭКК) и формирования новых, дочерних ПЭКК из отдельных клеток родительских ПЭКК [17]. Наличие проэмбриогенных масс, или ПЭКК - характерная черта большинства эмбриогенных культур [18]. Согласно гистологическим исследованиям, ПЭКК являются зародышами, остановленными на преглобулярной стадии развития добавлением ауксина в среду культивирования [19]. Однако, каким образом происходит "мультипликация" ПЭКК in vitro известно мало. В морфо-генном каллусе F. tataricum основная часть клеток ПЭКК в процессе разрыхления образует "мягкий" каллус, длинные баллонообразные клетки которого имеют слабые межклеточные контакты, сильно лигнифицированы и не способны к последующему делению [16, 17]. Было установлено, что появлению новых ПЭКК предшествует ослизение по-
Рис. 1. Морфогенный каллус Fagopyrum tataricum (Ь.) ОаегШ.: а - внешний вид, одинарной стрелкой указаны проэмб-риональные клеточные комплексы, двойными стрелками - мягкий каллус; б- гистологический срез проэмбриональ-ного клеточного комплекса, в - гистологический срез мягкого каллуса.
верхности предсуществующих ПЭКК [17, 20], что обусловлено секрецией определенных молекул на поверхность каллуса.
Цель работы - изучение динамики экстраклеточных полимеров (полисахаридов и белков) в ходе культурального цикла морфогенного и не-морфогенного каллуса гречихи татарской.
МЕТОДИКА
В работе использовали морфогенный (МК) и неморфогенный (НК) каллусы гречихи татарской Fagopyrum tataricum (Ь.) ваегШ. (рис. 1, 2). Морфогенный нодулярный каллус был получен из незрелого зародыша и состоял из ПЭКК и участков мягкого каллуса (рис. 1 а-в) ; морфология и
получение таких культур описаны нами ранее [19, 20]. ПЭКК - это структуры, образованные разными типами клеток, дифференцированность ПЭКК зависит от его величины и возраста. На рис.1б представлен гистологический срез "зрелого" ПЭКК, на стадии предшествующей разрыхлению. Видно, что срединная часть ПЭКК образована сильно вакуолизированными клетками с большими зернами крахмала в пластидах. На поверхности ПЭКК находятся крупные сшелушиваю-шиеся (погибающие) клетки. Ниже расположены слои слабо вакуолизированных клеток с плотной цитоплазмой. Сильное окрашивание толуидино-вым синим свидетельствует о высоком содержании белка в их цитоплазме. Мягкий каллус образуется в процессе разрыхления ПЭКК и в основном представлен сильно вакуолизированными, вытянутыми клетками (рис. 1в). Состоящий только из клеток паренхимного типа НК (рис. 2), был отсе-лектирован как клон, сформированный на МК, и отличался от него рыхлой структурой, высокой скоростью роста и полной утратой способности к морфогенезу [16]. Каллусные культуры поддерживали в термостате при температуре 26 ± 2°С на среде ИХ [21] , содержащей минеральные соли среды Гамбурга В5 [22] с добавлением (мг/мл): тиамина - 2.0; пиридоксина - 1.0; никотиновой кислоты - 1.0; гидролизата казеина - 2000; 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты - 2.0; индо-лилуксусной кислоты - 0.5; нафтилуксусной кислоты - 0.5; кинетина - 0.2; сахарозы - до 2.5% и 0.8% агара. НК пересаживали через каждые 3 нед, а МК - через каждые 4 нед.
Выделение экстраклеточных полимеров. Ага-ризованную среду, с которой тщательно удаляли каллус, центрифугировали в системе из двух пробирок (30 мин, 8000 §). Собранную жидкость пропускали через фильтры "М1гас1оШ", а затем "МП-Нроге" (США) с диаметром пор 0.22 мкм. Затем к большей части фильтрата добавляли этанол до конечной концентрации 80% и оставляли на 1224 ч при 4° С для осаждения полимеров. Осадок отделяли центрифугированием (8000 10 мин) и высушивали при комнатной температуре. В дальнейшем эту фракцию использовали для спектро-фотометрического анализа моносахаридов. Известно, что этанол способствует осаждению как полисахаридов, так и высоко гликозилированных белков [23], поэтому, чтобы получить фракцию белков, свободную от полисахаридов, к оставшейся части фильтрата добавляли ТХУ до конечной концентрации 15-20% для осаждения белков. Через 1 ч раствор центрифугировали (20000 10 мин), осадок отмывали охлажденным 80%-ным ацетоном и высушивали при комнатной температуре.
Содержание моносахаридов определяли по методике Резникова и др. [24]. К 1 мл экстраклеточных полимеров приливали 1 мл раствора 4 н. Н2Б04 и 1 ч выдерживали на кипящей водяной ба-
не. Затем, охладив, нейтрализовали 2 мл раствора
2 н. Na2CO3. К 2 мл орто-толуидинового реактива, приготовленного по методике Усова и Яроцкого [25], добавляли 250 мкл нейтрализованного гидролизата и выдерживали 30 мин на кипящей водяной бане. Поглощение моносахаридов измеряли на спектрофотометре "Carl Zeiss" (Германия) при
3 длинах волн: 630 (для гексоз), 385 (для пентоз) и 365 нм (для уроновых кислот). Количество моносахаридов в пробе рассчитывали в мкг/мг веса сухого каллуса по уравнению Фирордта [26].
Растворимые белки извлекали из каллусной ткани, замороженной в жидком азоте. Навеску растирали в 50 мМ трис-НС1-буфере (рН 7.4), содержащем (ммоль): трис - 50, сахароза - 300, KCl - 5, ЭДТА - 5, аскорбиновая кислота - 25, ДТТ - 10, фенилметимлсульфонилфторид - 1. Полученный гомогенат фильтровали через "Miracloth". Фильтрат центрифугировали (10000 g, 10 мин). Супер-натант использовали как растворимую фракцию белков. Содержание белка измеряли по методу Брэдфорд.
Гистологические исследования. Небольшие кусочки каллуса фиксировали 3.7%-ным пара-формальдегидом в стабилизирующем буфере SB (рН 6.9), содержащем (ммоль): PIPES (пиперазин-^№-бис(2-этансульфоновую кислоту) - 50, MgS04 ■ 7Н20 - 50, ЭДТА - 5) в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывания в буфере SB и в буфере PBS (pH 7.3), содержащем (ммоль): (NaCl - 140, KCl - 2.7, Na2HPO4 ■ 2H2O -6.5, KH2PO4 - 1.5, NaN3 - 3.0), образцы каллуса дегидрировали в среде этанола с постепенным уменьшением концентрации, разбавленного буфером PBS. Ткань затем заливали в низкоплавкий (35°C) воск Стидмана [27]. Срезы образцов (7 мкм толщины) делали на роторном микротоме Reichert OM U3 ("Reichert", Австрия) и расправляли в капле дистиллированной воды на стеклах с альбуминоглицерином. Высушенные срезы окрашивали 0.01%-ным толуидиновым синим в буфере PBS в течение 10 мин. Окрашенные толуидиновым синим срезы заключали в среду, содержащую п-фенилендиамин, и изучали, используя инвертированный микроскоп Axiovert 405 M фирмы "Carl Zeiss" (Германия). Срезы фотографировали на пленку.
Цитогенетические исследования. Каллус фиксировали 4-6 ч смесью этанол-уксусная кислота (3 : 1), отмывали от фиксатора 96%-ным этанолом и хранили до исследования в 70%-ном этаноле. Окрашивание хромосом производили 2%-ным пропионовым орсеином (2 г орсеина/
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.