УДК 576.315.42;576.32.36;57.012.5;57.088.3;577.344.3
ЭКСТРАКЦИЯ ГИСТОНА Н1 И ДЕКОНДЕНСАЦИЯ ЯДЕРНОГО ХРОМАТИНА С РАЗНЫМИ Mg-ЗАВИСИМЫМИ УРОВНЯМИ ОРГАНИЗАЦИИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПОЛИГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ДИСТАМИЦИНА
© 2015 А.Н. Прусов*, Т.А. Смирнова, Г.Я. Коломийцева
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: +7(495)939-3181, электронная почта: prusov@belozersky.msu.ru
Поступила в редакцию 27.09.14 После доработки 21.10.14
В условиях низкой ионной силы (20—25 мМ) и концентрации М^2+ от 2 до 5 мМ хроматин в ядрах печени крысы имеет конденсированную структуру (глобулы 100—200 нм) и дает одинаковый сигнал КД (320—340 нм) при взаимодействии с антибиотиком дистамицином А (ДМ). Снижение концентрации М^2+ до 1 мМ приводит к деконденсации хроматина до структур 30 нм и увеличению сигнала КД. Поли-(Ь)-глутаминовая кислота (ПГ) при ПГ/ДНК = 6 в присутствии 5 мМ М^2+ экстрагирует только восьмую часть ядерного гис-тона Н1, оставляя структуру хроматина конденсированной. Удаление одной четверти Н1 при 3 мМ М^2+ приводит к деконденсации хроматина до фибрилл 30 нм. Экстракция около половины гистона Н1 в среде с [М^2+] < 2 мМ разворачивает хроматин до нуклеосомного уровня. Деконденсация под действием ПГ приводит к значительному увеличению сигнала КД. Основная экстракция Н1 происходит за 1—2 мин, но при всех концентрациях М^2+ выявляется более медленно экстрагируемая с помощью ПГ фракция Н1, составляющая 5—7% ядерного Н1. Из оставшегося в ядре гистона Н1 около 25% может быть экстрагировано ПГ в присутствии насыщающей концентрации ДМ (ДМ/ДНК = 0,1). Выход Н1 существенно зависит от концентрации ПГ. Однако даже при высоких соотношениях ПГ/ДНК = 30 и ДМ/ДНК = 0,1 из ядра не удается удалить 5—10% гистона Н1. Деконденсация хроматина в ядре не всегда пропорциональна экстракции гистона Н1 и ослабляется в присутствии положительно заряженного ДМ или больших концентраций ПГ. Наши результаты показывают, что взаимодействие ДМ с хроматином зависит, прежде всего, от уровня его упаковки, а действие ПГ — от концентрации М^2+, поддерживающего данный уровень.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: клеточные ядра, хроматин, уровни структурной организации, дистамицин, полиглу-таминовая кислота, гистон Н1, спектры КД.
Понимание механизмов процессов транскрипции, репликации, репарации требует знания структурной организации in vivo их физиологического субстрата — ядерного хроматина, упакованного в ядре. Данные, положенные в основу современных, зачастую противоположных [1—3], представлений о принципах организации хроматина и многочисленных моделей, были получены в основном на выделенных или реконструированных препаратах хроматина в растворе [4], а также на модельных олигонуклеосомах [5].
Принятые сокращения: ПГ — поли-(Ь)-глутамино-вая кислота, Н1 — гистон Н1, ДМ — антибиотик дистамицин А, КД — круговой дихроизм, ЭМ — электронная микроскопия.
* Адресат для корреспонденции.
В настоящее время имеется весьма ограниченная информация о структуре хроматина на уровне ядра [6]. Ядро является сложной структурой, образованной множественными ком-партментами с различным микроокружением. Длинный полимер — хроматин — заполняет ядерный объем в концентрации до 20—40 мг/мл [7]. Столь высокие концентрации ДНК, РНК и белковых молекул в ядре обусловливают так называемый «сго'М'ё^^эффект [8]. Необходимо учитывать также взаимодействие хроматина с другими компартментами ядра и динамическое поведение макромолекул, в частности гистона Н1 [9, 10]. Очевидно, что условия существования и функционирования хроматина в ядре существенно отличаются от таковых в растворе.
Известно, что хроматин в клеточном ядре может находиться в нескольких структурных состояниях, различающихся плотностью упаковки ДНК: нуклеосомные фибриллы диаметром 10 нм, обеспечивающие 6-7-кратную упаковку ДНК — первичный уровень, фибриллы диаметром 30 и 100—200 нм — вторичный и третичный уровни соответственно [11]. Детально изучен пока лишь первичный, нуклеосомный уровень. Организация более высоких уровней остается дискуссионной и мало доступной экспериментальной проверке [12, 13]. Полагают, что в их формировании могут участвовать в т.ч. гистон Н1 и ионы магния.
В настоящей работе с помощью электронной микроскопии (ЭМ), спектроскопии кругового дихроизма (КД) и экстракционных методов мы изучили in vitro влияние высокомолекулярного полианиона — поли-(Ь)-глутаминовой кислоты (ПГ), экстрагирующей из ядерного хроматина гистон Н1, и противоопухолевого антибиотика дистамицина А (ДМ) на структуру хроматина с разными уровнями организации, моделируемыми концентрацией ионов магния.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Ядра клеток печени крысы выделяли, как описано ранее [14]. Печень гомогенизировали в буфере 20 мМ ТЭА-НС1 (pH 7,5), 30 мМ NaCl, 10 мМ MgC12 в присутствии ингибиторов эндо-нуклеазной и протеазной активности N-этилма-леимида («Sigma», США, до 3 мМ) и фенилме-тилсульфонилфторида («Serva», США, до 0,1 мМ) соответственно. Гомогенат смешивали с раствором 2,5 М сахарозы в том же буфере, но содержавшем 5 мМ MgC12, до конечной концентрации сахарозы 2,1 М и центрифугировали при 50 000 g в течение 45 мин. Ядерный осадок дважды отмывали от сахарозы в буфере 20 мМ ТЭА-НС1 (pH, 7,5) с 5 мМ MgC12, осаждая 5 мин при 1500 g. Осадок ресуспендировали в том же буфере, разделяли на аликвоты и центрифугировали 5 мин при 1500 g. Полученные аликвоты ядер ресуспендировали в буфере 20 мМ ТЭА-HC1 (рН 7,5), содержавшем MgC12 в разных концентрациях.
Обработку ДМ и ПГ проводили, как описано ранее [15]. К аликвотам суспензии ядер добавляли раствор антибиотика ДМ («Sigma», США, 5 мг/мл в этаноле) в нужном молярном соотношении с ДНК ядер и инкубировали 15 мин. ПГ («Sigma», США) добавляли к суспензии ядер (концентрация ДНК в суспензии — 70 мкг/мл), предварительно обработанных или необработанных ДМ, в равном объеме того же буфера до
нужного весового соотношения ПГ/ДНК и инкубировали в течение 15 мин.
Гистон Н1 экстрагировали из ядер, суспендированных в 20 мМ ТЭА-буфера (рН 7,5), содержавшего 0—5 мМ MgCl2, при помощи ПГ. Использовались растворы ПГ молекулярной массы 14,5, 45,0 и 95,0 кДа, приготовленные в буферах с соответствующей концентрацией Mg2+. Время экстракции и величину весового соотношения ПГ/ДНК варьировали. Суспензию центрифугировали 10 мин при 10 000 g. К супернатанту добавляли ТХУ до 20%, инкубировали 1 ч при —20° и центрифугировали 10 мин при 10 000 g. Осадки ядер и супернатанта промывали ацетоном, высушивали и растворяли в буфере для электрофореза.
Концентрацию ДНК и РНК в ядрах определяли после гидролиза аликвоты в 5%-ной HClO4 [16].
Измерения КД и УФ-поглощения были выполнены на КД-спектрометре Chirascan Plus («Applied Photophysics», Великобритания) при 18° в диапазоне 240—420 нм в односантиметровой кварцевой кювете в положении, близком к фотоумножителю. Концентрация ДНК в суспензии ядер составляла 35 мкг/мл.
Электрофорез белков в присутствии Ds-Na проводили по Лэммли [17] в 15%-ном разделяющем геле. Количество белка в полосах определяли с помощью компьютерной программы GelPro Analyser 3.1 с использованием калибровочной кривой, построенной по суммарному Н1 клеток печени крысы. Выход гистона Н1 оценивали в % от суммы Н1 в супернатанте и осадке.
Для электронной микроскопии образцы фиксировали 1%-ным глутаровым альдегидом (нейтрализованным до рН 7,0 добавлением NaOH) при 4° в течение 1,5 ч, а затем 1%-ным OsO4 в течение 1 ч, дегидратировали и заключали в Эпон по стандартной методике. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-III («LKB», Швеция), контрастировали цитратом свинца и просматривали в электронный микроскоп Hitachi-700 («Hitachi», Япония) или JEM-1400 («JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении ~75 кВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Ядра клеток печени крысы, полученные в присутствии 5 мМ М^2+, переводили в буферы с понижающейся концентрацией М^2+. На рис. 1 приведена ЭМ-картина участков ядер. Перевод ядер в буферы с концентрацией М^2+ от 5 до 2 мМ практически не изменял морфологию хроматина в сравнении с исходным ядром: ядерный хроматин был представлен конденсированными глобулами и фибриллами диамет-
Рис. 1. Электронограммы ультратонких срезов изолированных ядер печени крысы в буфере 20 мМ ТЭА-НС1 (рН 7,5). Ядра в буфере, содержавшем 1 (а) или 2 (б) мМ М^2+; в — ядро в буфере с 2 мМ М^2+, обработанное ДМ (ДМ/ДНК = 0,1) и ПГ (ПГ/ДНК = 6); г, д — ядра в буфере с 5 мМ Мк2+, обработанные ПГ при ПГ/ДНК = 20 (г) или ПГ/ДНК = 30 (д); ядра, обработанные ПГ при ПГ/ДНК = 6 в присутствии 1 (е), 2 (ж), 3 (з), 4 (и) или 5 (к) мМ Mg2+. Масштабный отрезок — 0,2 мкм
ром ~100—200 нм (рис. 1, б). При снижении концентрации Mg2+ до 1 мМ картина меняется. Хроматин в ядрах выглядит как фибриллы и гранулы диаметром ~30 нм, более-менее равномерно заполняющие внутреннее пространство ядра (рис 1, а). Таким образом, в интервале концентраций Mg2+ от 2 до 1 мМ в среде низкой ионной силы в выделенных ядрах in vitro происходит структурный переход хроматина из фибрилл 100—200 нм в фибриллы 30 нм.
УФ-спектры препаратов ядер при [Mg2+] = = 1—5 мМ показаны на рис. 2, а. Спектры снимались в условиях, минимизирующих вклад светорассеяния, а именно при положении кюветы вплотную к детектору [18]. Как видно, УФ-спектр ядер имеет плоский максимум в диапазоне 260—280 нм и характеризуется относительно высоким поглощением при X > 300 нм. Эти свойства примерно одинаковы для ядер в интервале [Mg2+] = 2-5 мМ. В буфере с [Mg2+] = 1 мМ поглощение в максимуме слегка возрастает, пик становится более острым, а поглощение при X > 300 нм существенно снижается (рис. 2, а, 1 мм Mg2+). Описанные нами оптические свойства ядер согласуются с данными авторов Олинс Д.Е. и Олинс А.Л. [18], которые определяют ядра при [Mg2+] = 5 мМ как «гранулированные», а при [Mg2+] = 1 мМ — как «гомогенные».
Спектр КД выделенных ядер (рис. 2, б) похож на спектр выделенного хроматина [19]. Ядра в буфере с [Mg2+] = 2—5 мМ («гранулированные ядра» с фибриллами 100—200 нм) проявляют сглаженный дихроизм с максимумом (иногда двугорбым) в облас
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.