ОНТОГЕНЕЗ, 2013, том 44, № 2, с. 136-140
КЛЕТОЧНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И ПРОЛИФЕРАЦИЯ
УДК 62.018.2:017.12
ЭКСТРАТИМИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И АНТИГЕНРАСПОЗНАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ арТ-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ У МЫШЕЙ © 2013 г. Е. М. Куклина*, С. В. Ширшев, Н. С. Глебездина
Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, 614081 Пермь, ул. Голева, д. 13
*E-mail: ibis_07@mail.ru Поступила в редакцию 12.08.11 г.
Окончательный вариант получен 17.11.11 г.
Изучена реактивность aßT-лимфоцитов беременных самок СВА в отношении антигенов самца, а также наличие процессов реаранжировки генов антигенного рецептора Т-клеток в периферических лимфоидных органах мышей при трех вариантах скрещивания: СВА х BALB/с (нормальная алло-генная беременность), СВА х СВА (сингенная беременность) и СВА х DBA/2 (склонная к аборту комбинация). Показано, что пролиферативный ответ aßT-лимфоцитов беременных самок СВА на клетки селезенки самца наиболее выражен при нормальной аллогенной беременности, в меньшей степени — при сингенной беременности, и не выявляется в комбинации СВА х DBA/2. При этом клетки парааортальных лимфатических узлов (дренирующих матку) отвечают на антигены самца достоверно эффективнее, чем лимфоциты мезентериальных и подмышечных лимфатических узлов. Одновременная оценка экспрессии рекомбиназы RAG-1, ключевого фермента реаранжировки генов Т-клеточного рецептора, выявила аналогичные закономерности — преимущественную активность рекомбиназы в Т-лимфоцитах парааортальных лимфатических узлов беременных самок СВА, что указавает на связь экстратимической реаранжировки генов антигенного рецептора с изменением антигенраспознающего репертуара этих клеток. Обсуждается возможное биологическое значение выявленного феномена.
Ключевые слова: арТ-лимфоциты, экстратимическая дифференцировка, реаранжировка генов ТСЯ, антигенраспознающий репертуар, смешанная культура лимфоцитов, беременность.
DOI: 10.7868/S0475145013020079
Предыдущими исследованиями мы выявили неизвестный ранее феномен — индукцию реаранжировки генов Т-клеточного рецептора (T Cell Receptor, TCR) в периферических Т-лимфоцитах при беременности (Ширшев и др., 2007). В частности, мы показали экспрессию ключевого маркера реаранжировки, рекомбиназы RAG-1 (Recombination Activating Genes), в Т-клетках периферических лимфоидных органов беременных мышей. Теоретически, такой процесс должен сопровождаться появлением на мембране Т-лимфоцита нового антигенного рецептора, с измененной специфичностью (Куклина, 2006). А поскольку на периферии отсутствуют условия, обеспечивающие эффективную клональную селекцию вновь образующихся Т-клеток (как это в норме происходит в тимусе), реаранжировка генов TCR в периферических лим-фоидных органах неизбежно должна сопровождаться изменением антигенраспознающего репертуара Т-лимфоцитов, в частности, появлением аутореактивных Т-клеточных клонов.
Целью настоящей работы было сопоставление антигенраспознающей активности арТ-лимфо-цитов беременных мышей с таковой для небеременных, с одновременной оценкой рекомби-назной активности в этих клетках, при разных вариантах скрещивания — нормальном аллогенном, сингенном и в склонной к аборту комбинации.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В работе использовались линейные самки мышей CBA, которых скрещивали с самцами разных линий — BALB/c (нормальная аллогенная беременность), CBA (нормальная сингенная беременность) и DBA/2 (склонная к аборту комбинация) (Chaouat et al., 1983; Lin et al., 2004). Животные были получены из питомника РАМН ("Рапполово", Санкт-Петербург). Беременность фиксировали по появлению вагинальной пробки. Срок беременности у животных (9-е сутки) подбирался в соответствии с тем, что у самок CBA х DBA/2 аборты про-
ЭКСТРАТИМИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
137
исходят, как правило, на 10—14 день беременности (Chaouat et al., 1983; Lin et al., 2004).
Объектами исследования служили тимоциты и фракционированные периферические Т-лимфоциты, выделенные из лимфоузлов трех разных типов — парааортальных (дренирующих матку), а также мезентериальных и подмышечных (не дренирующих матку) (Lin et al., 2004). В основной серии экспериментов при фракционировании Т-лимфоцитов из клеточной суспензии, полученной в результате гомогенизации лимфоузлов, удаляли В-лимфоциты, способные в норме реаран-жировать цепи антигенного рецептора на периферии (Hikida et al., 1996), — с помощью специфической антисыворотки к иммуноглобулинам мыши ("Медгамал", Россия). В заключительной серии экспериментов для исключения влияния на результат минорной субпопуляции у8Т-лимфоци-тов, традиционно дифференцирующихся вне тимуса и также экспрессирующих белки RAG на периферии (Mincheva-Nilsson et al., 1997; Robey, Fowlkes, 1998) из клеточной суспензии направленно выделялись aßT-лимфоциты — иммуномагнит-ным фракционированием с помощью монокло-нальных антител H57-597 к ß-цепи TCR мыши ("Caltag", США).
В клетках оценивали экспрессию мРНК реком-биназы RAG-1, а также ß-актина (положительный контроль на наличие мРНК в пробе).
Выделение РНК, обратную транскрипцию и амплификацию проводили с помощью соответствующих наборов ("Лаборатория Изоген", Россия): для выделения тотальной РНК (Trizol RNA Prep 100), для обратной транскрипции (GenePak RT Core) и для амплификации (GenePak PCR Core). В работе использовались следующие специфические праймеры и соответствующие режимы амплификации: для RAG-1 — 5'-CATC-GAGACAGTCCCTTCC-3' и 5'-CGATAGAGC-CATCCCTTTC-3' (Vaitaitis et al., 2003), 92°С x x 30 с, 60°С x 30 с, 72°С x 60 с, 35 циклов; для ß-актина - 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3' и 5'-TTTGATGTCACGCACGATTT-3' (подобраны с помощью программы Primer 3: http:// frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi), 92°С x 30 с, 60°С x 30 с, 72°С x 60 с, 30 циклов.
Электрофорез проводили стандартным методом в 1.5% геле агарозы ("Serva", Германия).
Антиегнраспознающую активность Т-клеток при беременности оценивали по пролиферативно-му ответу фракционированных aßТ-лимфоцитов лимфатических узлов беременных мышей (2 x x 105 на пробу) на антигены самцов соответствующих линий и небеременных самок, в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов. В качестве стимулирующих клеток использовали клетки селезенки мышей, а также, в ряде экспериментов, фракционированные aßТ-лимфоциты подмышечных и мезентериальных лимфатических узлов
(2 х 105 на пробу), предварительно обработанных митомицином С (25 мкг/мл). Клетки культивировали 72 часа. Результаты оценивали в МТТ-тесте, основанном на определении количества жизнеспособных клеток в пробе (Wei et al., 2005). Для этого за 4 часа до окончания культивирования в пробы вносили МТТ (водорастворимая соль тетра-золия, полное название — (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5)-diphenyltetrazolium bromide) в конечной концентрации 0.5 мг/мл. После культивирования пробы центрифугировали (1500 об./мин х 10 мин), удаляли супернатант и вносили изопропанол для солюбилизации формазана, образующегося из МТТ при разрезании тетразолиевого кольца де-гидрогеназами и откладывающегося в клетке в виде гранул. Количество образовавшегося формазана оценивалось спектрофотометрически при длине волны 570 нм. Индекс пролиферации определялся как отношение соответствующих показателей оптической плотности для стимулированной (клетками самца) и не стимулированной проб.
Статистический анализ проводился с использованием i-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ пролиферативного ответа аРТ-лимфо-цитов беременных самок СВА на антигены самцов соответствующих линий показал, что при нормальной беременности (и сингенной, и аллоген-ной) индекс пролифереции Т-клеток, определяемый как отношение показателей пролифератив-ной активности в стимулированной и нести-мулированной пробах, выше, чем у небеременных животных (табл. 1), но зависит от происхождения Т-клеток — конкретно, от типа лимфатических узлов, из которых они получены. Наиболее выраженным этот эффект был при нормальной алло-генной беременности (СВА х BALB/c) для Т-лим-фоцитов парааортальных лимфоузлов (дренирующих матку), существенно меньшим, но статистически значимым — для подмышечных, тогда как для Т-клеток мезентериальных лимфатических узлов ответ на антигены самца не отличался от такового для небеременных самок СВА. Более того, достоверные различия в индексах пролиферации были выявлены и в пределах одной группы животных: ответ Т-клеток у беременных самок СВА х BALB/c был выше в парааортальных лимфатических узлах по сравнению с мезентериаль-ными (табл. 1). В отличие от нормальной беременности, в комбинации СВА х DBA/2, характеризующейся высоким уровнем спонтанных абортов, ответа периферических Т-клеток на антигены самцов DBA/2 не выявлено (табл. 1). Возможно, отсутствие ответа в данной модели и является одной из причин предрасположенности к абортам, поскольку, согласно современным представлениям, для успешной имплантации и плацентации необ-
138
КУКЛИНА и др.
Таблица 1. Пролиферативный ответ периферических аРТ-лимфоцитов самок СВА на антигены самца в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов
Отвечающие клетки (аРТ-лимфоциты самки) Индекс стимуляции (М ± т)
Стимулирующие клетки (клетки селезенки самца)
БЛЬБ/с СВА ББЛ/2
Небеременные самки СВА парааортальные ЛУ мезентериальные ЛУ подмышечные ЛУ 1.47 ± 0.081 1.39 ± 0.089 1.37 ± 0.109 н.д. 1.19 ± 0.074 1.18 ± 0.062 1.21 ± 0.048
Беременные самки СВА х БЛЬБ/с парааортальные ЛУ мезентериальные ЛУ подмышечные ЛУ 2.09 ± 0.222* 1.49 ± 0.124 1.69 ± 0.196*
Беременные самки СВА х СВА парааортальные ЛУ мезентериальные ЛУ подмышечные ЛУ 1.72 ± 0.183 1.66 ± 0.178 1.46 ± 0.138
Беременные самки СВА х ББЛ/2 парааортальные ЛУ мезентериальные ЛУ подмышечные ЛУ 1.083 ± 0.042а ъ 1.11 ± 0.045 ъ 1.01 ± 0.035*, а< ъ
Примечания: в каждой группе 8—10 животных; ЛУ — лимфатические узлы; н.д. — нет данных; индекс пролиферации определялся как отношение соответствующих показателей оптической плотности для стимулированной (клетками селезенки самца) и не стимулированной проб.
*р < 0.05 (сопоставление с ответом Т-клеток соответствующих лимфатических узлов небеременных самок). ар
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.