МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, том 42, № 1, с. 24-31
== ОБЗОРЫ
УДК 577.24
ЭКСЦИЗИОННАЯ РЕПАРАЦИЯ НУКЛЕОТИДОВ У ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ: МЕХАНИЗМ ПЕРВИЧНОГО УЗНАВАНИЯ
ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК
© 2008 г. Н. И. Речкунова, Е. А. Мальцева, О. И. Лаврик*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию 12.03.2007 г.
Принята к печати 27.04.2007 г.
Эксцизионная репарация нуклеотидов - один из важнейших путей репарации ДНК в клетках эука-риот. Этот процесс обеспечивает удаление из ДНК таких структурно различных повреждений, как пиримидиновые димеры, возникающие под действием УФ-излучения, объемные химические аддук-ты, которые образуются при попадании в клетку канцерогенов, а также некоторых химиотерапев-тических средств. Дефекты в системе репарации нуклеотидов приводят к тяжелым заболеваниям, в том числе, к некоторым формам рака. Широкая субстратная специфичность репарации нуклеотидов делает актуальным изучение механизмов узнавания поврежденных участков ДНК определенным набором белков в контексте огромного массива неповрежденной ДНК. В обзоре главный акцент сделан на ключевом и до сих пор наиболее спорном этапе процесса эксцизионной репарации нуклеотидов - узнавании повреждений в ДНК. Рассмотрены основные модели первичного узнавания повреждения и сборки предрасщепляющего комплекса. Приведенные данные позволяют считать наиболее вероятной модель последовательного связывания белков репаративного комплекса с поврежденной ДНК.
Ключевые слова: эксцизионная репарация нуклеотидов, факторы репарации, узнавание повреждения.
NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR IN MAMMALIA: MECHANISM OF A PRIMARY DAMAGE RECOGNITION, by N. I. Rechkunova, E. A. Maltseva, O. I. Lavrik* (Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, 630090, Russia; *e-mail: Lavrik@niboch.nsc.ru). Nucleotide excision repair is one of the most important pathways of DNA repair in eukaryotic cells. Defects of this system lead to serious diseases including certain kinds of cancer. Nucleotide excision repair is able to remove a wide range of the structurally diverse DNA damages such as UV induced pyrimidine dimers, bulky chemical adducts arising under the action of carcinogenic compounds or chemotherapeutical drugs on cellular DNA. A broad substrate specificity of this repair pathway is related to the main intriguing question that is the mechanism of damage recognition by the protein complex in the context of the large excess of undamaged DNA. This review is detailed on the key stage of nucleotide excision repair - the recognition of a lesion in DNA, which is still most debated. We have considered the main models of a primary damage recognition and preincision complex formation that have been suggested by the leading groups in this field. Data presented allow to suggest the model of sequential loading of the proteins of reparative complex on damage DNA as the most reasonable.
Key words: nucleotide excision repair, repair factors, damage recognition.
ДНК в клетке постоянно повреждается эндогенными реакционноспособными метаболитами и экзогенными факторами. Генетическая стабильность организмов контролируется различными механизмами репарации [1-3], среди которых важное место занимает эксцизионная репарация нуклеотидов (КЕЯ). Этот процесс обеспечивает удаление повреждений, нарушающих двойную спи-
Принятые сокращения: NER - эксцизионная репарация нуклеотидов; CPD - циклобутанпиримидиновый димер.
*Эл. почта: lavrik@niboch.nsc.ru
раль ДНК, например пиримидиновых димеров, образующихся при облучении УФ-светом, или объемных химических аддуктов, возникающих под действием факторов окружающей среды либо химиотерапевтических средств. NER - сложный процесс, который требует координированного действия, по меньшей мере, 25-30 полипептидов [5]. Существуют два пути удаления повреждений: репарация целого генома (global genome repair, GGR), в результате которой повреждения удаляются из всей геномной ДНК [6]; и репарация, свя-
занная с транскрипциеи, которая ограничивается удалением повреждении в транскрибируемой цепи ДНК и тесно связана с функционированием РНК-полимеразы II [7]. Остановка РНК-полиме-разы II служит сигналом для сборки комплекса белков, осуществляющих репарацию. В случае GGR-NER узнавание повреждения представляет собоИ наиболее сложныИ этап, механизм которого до сих пор окончательно не определен, несмотря на значительные результаты, полученные различными методами, в том числе in vivo. До сих пор нет единого мнения о том, какоИ из факторов NER первым узнает повреждение. До конца не изучена последовательность сборки комплекса факторов NER на поврежденноИ ДНК, состав и время жизни определенных промежуточных структур, а также точныИ механизм реакции. В данном обзоре рассмотрены современные представления о механизме узнавания повреждения и сборки ансамбля белков в процессе репарации целого генома (GGR-NER) в клетках высших эукариот.
ПОРЯДОК СБОРКИ ФАКТОРОВ В GGR-NER
Молекулярный механизм процесса GGR-NER в целом изучен достаточно хорошо. Известно, что удаление повреждений происходит последовательно и включает следующие стадии (рисунок): узнавание повреждения, расплетание ДНК вблизи повреждения (образование открытого комплекса), вырезание повреждения в составе олигонук-леотида и застройка образовавшейся одноцепо-чечной бреши (стадия ресинтеза ДНК). Процесс GGR-NER реконструирован в системе in vitro [6]. Показано, что для репарации большинства повреждений необходимо и достаточно шести коровых факторов репарации: XPC-hHR23B, XPA, RPA, TFIIH, XPG и XPF-ERCC1. Предложены три модели сборки комплекса NER на поврежденной ДНК: репаросомная модель, модель согласованного связывания и модель последовательного связывания.
Репаросомная модель предполагает существование в клетках "репаросомы" - комплекса из шести или более белков, который постоянно осуществляет сканирование повреждений в геноме. В пользу этой модели свидетельствует соочистка некоторых факторов репарации при выделении их из клеточных экстрактов дрожжей или человека [8]. Эта модель позволяет обойти вопрос о быстрой и хорошо согласованной сборке большого количества белков в месте повреждения. Однако в настоящее время модель считается неприемлемой в силу ряда причин: 1) совместно очищаемые факторы репарации легко разделяются в достаточно мягких условиях; 2) in vitro невозможно сформировать стабильный предрас-щепляющий комплекс, в котором одновременно
ХРС-ЬИЯ23Б-центрин2 XPE (DDB) XPA RPA
TFIIH (ХРБ-3'-5'-геликаза, XPD-5'-3'-геликaзa)
5'-
3'-
XPF-ERCC1
XPG
Ц_1_5-25 н-2.3-9 4
5' 3'
ДНК-полимераза е/8 RFC PCNA RPA
5' 3'
24-32 н.
ДНК-лигаза I
Схема эксцизионной репарации нуклеотидов. а - Поврежденная ДНК; б - узнавание повреждения и формирование открытого комплекса; в - вырезание поврежденного участка; г - ресинтез ДНК.
находились бы XPC-hHR23B и XPG; 3) масса функ-циональноИ "репаросомы" оценивается в 3 МДа, что затрудняет поиск повреждения в геноме на уровне хроматина и не согласуется со скоростью диффузии флуоресцентно меченных белков к месту повреждения in vivo [9, 10].
Модель согласованного связывания предполагает, что белки с умеренноИ специфичностью к поврежденноИ ДНК - XPC-hHR23B, XPA и RPA -могут образовывать троИноИ комплекс, специфичность к поврежденноИ ДНК в котором повышается благодаря аддитивному эффекту. Известно, что XPA и RPA образуют прочныИ комплекс, которыИ обладает б0льшим сродством к поврежденноИ ДНК, чем любоИ из факторов в отдельности. Методом задержки в геле обнаружены комплексы XPC-RPA-ДНК и XPA-RPA-ДНК, но не удалось зафиксировать комплекс XPC-XPA-RPA-ДНК. В опытах по футпринтингу показан стимулирующиИ эффект XPA и RPA, но в боль-шеИ степени комплекса XPA-RPA на расщепление ДНК в комплексе с XPC [11]. Однако из этих данных еще не следует, что образуется общиИ ДНК-белковыИ комплекс. Модель согласованного связывания не может быть полностью отвергнута, но требует дополнительноИ эксперимен-тальноИ проверки.
Модель последовательного связывания подразумевает определенный порядок связывания факторов репарации с поврежденноИ ДНК. Конкретное
а
Белковые факторы, участвующие в узнавании повреждения ДНК в процессе СОЯ-МЕЯ
Фактор Субъединица Свойства полипептида, активность Функция белка в ООЯ-МЕЯ
XPC-hHR23B XPC (p125) Связывание ДНК Узнавание повреждения
HR23B (p58) Са2+-связывающий белок
Центрин 2 (p18)
DDB DDB1 (p125) DDB2 (p48) Связывание ДНК Узнавание некоторых повреждений (СРБ) Реорганизация хроматина
XPA XPA (p36) Содержит 7п2+-палец Связывание ДНК Сборка ансамбля Узнавание и (или) верификация повреждения?
RPA RPA70 (p70) Содержит 7п2+-палец Связывание ДНК Стабилизация одноцепочечных
RPA32 (p32) Связывание ДНК участков ДНК
RPA14 (p14) Сборка гетеротримера Узнавание повреждения?
TFIIH XPB (p89) ДНК-зависимая АТРаза, 3'-5'-геликаза Раскручивание ДНК-дуплекса
XPD (p80) ДНК-зависимая АТРаза, 5'-3'-геликаза Сборка ансамбля
p62 Коровая субъединица
p52 Коровая субъединица
p44
p34
CDK7 (p40) Протеинкиназа
Циклин H (p36)
MAT1 (p32)
p8
подтверждение эта модель нашла лишь в последнее время благодаря серии опытов, проведенных in vivo, с использованием флуоресцентно меченных белков. В качестве флуоресцентной метки использовали белок GFP (green fluorescent protein), ковалентно связанный с исследуемым фактором репарации [9, 10]. Показано, что GFP-ERCC1, GFP-XPB и GFP-XPA, свободно перемещающиеся в ядрах необлученных клеток, после УФ-облуче-ния мигрируют к месту облучения и временно иммобилизуются на поврежденной ДНК. Коэффициенты диффузии этих белков пропорциональны их молекулярным массам, что не согласуется с существованием в клетке большой "репаросомы". Однако не исключено, что индивидуальные белки способны образовывать более крупные комплексы друг с другом уже на повреждении. Эти комплексы могут быть динамичными и неустойчивыми, поэтому они не выявляются известными методами.
ПРЕИМУЩЕСТВА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОЙ С
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.