БИОХИМИЯ, 2G11, том 76, вып. 1, с. S2 - 45
УДК 577.24
ЭКСЦИЗИОННАЯ РЕПАРАЦИЯ НУКЛЕОТИДОВ:
УЗНАВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК И ФОРМИРОВАНИЕ ПРЕДРАСЩЕПЛЯЮЩЕГО
КОМПЛЕКСА
Обзор
© 2011 г. Н.И. Речкунова*, Ю.С. Красикова, О.И. Лаврик
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8; факс: (383)363-5153, электронная почта: nadyarec@niboch.nsc.ru
Поступила в редакцию 30.08.10 После доработки 08.09.10
Эксцизионная репарация нуклеотидов относится к числу основных путей репарации ДНК в клетках эука-риот. В процессе нуклеотидной репарации происходит удаление из ДНК широкого спектра структурно различающихся повреждений, таких как пиримидиновые димеры, возникающие под действием УФ-облуче-ния, объемные химические аддукты, возникающие при попадании в клетку канцерогенных веществ, а также в результате химиотерапии. Дефекты в системе нуклеотидной репарации приводят к тяжелым заболеваниям, в том числе некоторым формам рака. Широкая субстратная специфичность этого пути репарации делает актуальным вопрос о механизме узнавания поврежденных участков ДНК определенным набором белков в контексте огромного массива неповрежденной ДНК. Другой ключевой момент эксцизионной репарации нуклеотидов — сборка предрасщепляющего комплекса, обеспечивающего удаление поврежденного участка с сохранением целостности нативной цепи ДНК-дуплекса. Рассмотрены основные механизмы этих двух ключевых стадий процесса. Обсуждаются также возможности и результаты использования аффинной модификации в исследовании нуклеотидной репарации.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эксцизионная репарация нуклеотидов, факторы репарации, узнавание повреждения, предрасщепляющий комплекс, фотоаффинная модификация.
Действие эндогенных реакционноспособ-ных метаболитов и экзогенных факторов приводит к различным повреждениям клеточной ДНК. Генетическая стабильность организмов обеспечивается широким спектром механизмов репарации [1—4], среди которых важное место занимает эксцизионная репарация нуклеотидов. Этот процесс обеспечивает удаление множества повреждений, нарушающих двойную спираль ДНК, например пиримидиновых диме-ров, образующихся при облучении УФ-светом, или объемных химических аддуктов, возникающих под действием факторов окружающей среды либо химиотерапии. МЕЯ — Сложный процесс, в котором задействовано не менее 30 по-
Принятые сокращения: NER — эксцизионная репарация нуклеотидов (nucleotide excision repair); RPA — реп-ликативный белок А; XP — Xeroderma pigmentosum; Cen2 — белок центрин-2; н.о. — нуклеотдный остаток; а.о. — аминокислотный остаток.
* Адресат для корреспонденции.
липептидов [5, 6]. Существуют два пути удаления повреждений: репарация целого генома (global genome repair (GG-NER)), удаляющая повреждения во всей геномной ДНК, и репарация, связанная с транскрипцией (transcription coupled repair (TC-NER)), с помощью которой происходит удаление повреждений в транскрибируемой цепи ДНК. Процесс TC-NER связан с функционированием РНК-полимеразы II [7], остановка которой на повреждении является сигналом для сборки комплекса белков, осуществляющих репарацию. В случае GG-NER механизм узнавания повреждений долгое время оставался неопределенным, несмотря на интенсивные исследования, проводимые различными методами, в том числе in vivo. Только в последние несколько лет большинство исследователей согласились, что среди факторов NER гетеро-тример XPC—Rad23B—Cen2 первым узнает повреждение. До конца не определены последовательность сборки комплекса факторов NER на поврежденной ДНК, композиция и время жиз-
ни промежуточных структур, а также точный механизм реакции. В настоящем обзоре рассмотрены современные представления о механизме узнавания повреждения и сборки ансамбля белков в процессе репарации целого генома в клетках высших эукариот.
ПРЕИМУЩЕСТВА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОЙ
СБОРКИ КОМПЛЕКСА GG-NER: ДИНАМИЧНОСТЬ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГИБКОСТЬ СИСТЕМЫ
Молекулярный механизм процесса GG-NER в целом изучен достаточно хорошо. Известно, что удаление повреждений происходит последовательно и включает в себя стадии (схема 1) узнавания повреждения, расплетания ДНК вблизи повреждения (образование открытого комплекса), вырезания повреждения в составе олиго-нуклеотида и застройки образовавшейся одно-цепочечной бреши (стадия ресинтеза ДНК). Процесс GG-NER был реконструирован в системе in vitro [8—10]. Показано, что для прохождения стадии вырезания в процессе репарации большинства повреждений in vitro необходимо и достаточно шести коровых факторов репарации: XPC-hHR23B, XPA, RPA, TFIIH, XPG и ERCC1—XPF. Субъединичный состав и основные свойства этих факторов репарации приведены в таблице.
В ходе исследований системы GG-NER были предложены три модели сборки комплекса NER на поврежденной ДНК: репаросомная модель, модель согласованного связывания и модель последовательного связывания. Репаро-сомная модель предполагала существование в клетках «репаросомы» — комплекса из шести или более белков, который постоянно сканирует геном на наличие повреждения. В модели согласованного связывания предполагалось, что белки с умеренным сродством к поврежденной ДНК (XP^hHR23B, XPA и RPA) могут образовывать тройной комплекс, сродство которого к поврежденной ДНК повышается благодаря аддитивному эффекту. Однако наиболее достоверные данные были получены в пользу модели последовательного связывания, подразумевающей определенный порядок связывания факторов репарации с поврежденной ДНК. Эти данные — результат серии экспериментов, проведенных in vivo с использованием флуоресцентно-меченных белков. В качестве флуоресцентной метки использовали белок GFP (green fluorescent protein), ковалентно связанный с исследуемым фактором репарации [11—13]. Было показано, что GFP—ERCC1, GFP—XPB и GFP—XPA,
свободно перемещающиеся в ядрах необлучен-ных клеток, после УФ-облучения мигрируют к месту облучения и временно иммобилизуются на поврежденной ДНК. Коэффициенты диффузии белков были пропорциональны их молекулярным массам, что не согласуется с существованием в клетке большой «репаросомы». Не исключено, что индивидуальные белки могут образовывать более крупные комплексы друг с другом уже на повреждении. Эти комплексы могут быть динамичными и неустойчивыми, поэтому они не детектируются известными методами.
Предварительная сборка белков в «репаро-сому» удобна, поскольку позволяет в любе время эффективно начать репарацию, однако динамическая диссоциация/ассоциация белков увеличивают число возможных комбинаций и делают систему более гибкой и полифункциональной. Это позволяет белкам, участвующим в других путях метаболизма ДНК, быстро пере-
3'
...............
flSt] [Йй
I.....шдш
XPC-hHR23B-Cen2
5'; ..........ïOiïirnWN
XPA
XPF-ERCC1
TFIIH
XPB (3'^5'-геликаза) XPD (5'^3'-геликаза)
П XPG
ндпшш
ДНК-пол S | ДНК-пол е ДНК-лигаза1 ДНК-лигазаШ/XRCCI
RPA RFC PCNA
Схема 1. Эксцизионная репарация нуклеотидов
Коровые белки процесса GG-NER
Белок Субъединичный состав Свойства и активности Функции в ОО-МЕЯ
XPC—hHR23B XPC (p125) HR23B (p58) связывание ДНК стабилизация гетеродимера первичное узнавание повреждения
XPA XPA (p36) содержит Zn2+-палец, связывание ДНК сборка ансамбля, узнавание и (или) верификация повреждения(?)
RPA RPA70 (p70) RPA32 (p32) RPA14 (p14) то же связывание ДНК сборка гетеротримера, связывание ДНК стабилизация одноцепочечных участков ДНК, узнавание повреждения (?)
TFIIH XPB (p89) XPD (p80) p62 p52 p44 p34 CDK7 (p40) Cyclin H (p36) MAT1 (p32) p8 ДНК-зависимая АТРаза, 3'^5'-геликаза ДНК-зависимая АТРаза, 5'^3'-геликаза коровые субъединицы то же содержит Zn2+-палец содержит домен «ring finger» протеинкиназа регуляторные субъединицы протеин-киназы стабилизация комплекса раскручивание ДНК-дуплекса, сборка ансамбля, детекция повреждения
XPG XPG (p133) структурно-специфичная эндонуклеаза расщепление ДНК с З'-стороны от повреждения
ERCC1-XPF ERCC1 (p40) XPF (p115) стабилизация гетеродимера структурно-специфичная эндонуклеаза расщепление ДНК с 5'-стороны от повреждения
ключаться с одного процесса на другой. Известно, что все факторы МЕЯ вовлечены в другие процессы метаболизма ДНК. Комплекс ХРС—ИНЮЗВ взаимодействует с некоторыми ДНК-гликози-лазами (ферментами эксцизионной репарации оснований) и, возможно, является «переключателем» между процессами эксцизионной репарации оснований и нуклеотидов [14, 15]. Малая субъединица комплекса НЯ23В участвует в про-теолитической деградации белков на 26S-про-теасоме [16]. Многосубъединичный комплекс TFIIH, открытый исходно как фактор транскрипции [17], участвует также в контроле клеточного цикла [18]. Эксцизионная нуклеаза ЕЯСС1—XPF участвует в рекомбинационной репарации [19], а ХРО выполняет дополнительную функцию в эксцизионной репарации оснований [20]. Долгое время считалось, что ХРА задействован только в процессе МЕЯ, однако не так давно появились данные об его участии в передаче клеточных сигналов в ответ на повреждение ДНК [21—23]. ЯРА — Один из самых многочисленных белков в ядре клетки — задействован
по крайней мере в репликации, репарации и гомологичной рекомбинации ДНК [24—26] и имеет домены связывания со многими белками, вовлеченными в различные пути репарации.
Модель последовательного связывания подразумевает существование белков, ответственных за узнавание повреждения и последующее привлечение остальных факторов репарации к месту повреждения. До сих пор нет единого мнения о том, какой из факторов NER первым узнает повреждение. Предполагается, что эту роль могуть играть белки, обладающие более высоким сродством к поврежденной ДНК по сравнению с неповрежденной: XPC—hHR23B, XPA и RPA. В узнавании циклобутанпиримиди-новых димеров (CPD), образующихся в ДНК при УФ-облучении, участвует специализированный белок UV-DDB (UV-damaged DNA-binding protein), обеспечивающий посадку на поврежденный участок XPC—hHR23B [27—30]. Система GG-NER распознает повреждение на фоне большого объема неповрежденной ДНК. В то же время ни один из перечисленных факто-
ров не обладает преимущественным сродством к повреждению [31]. Возможно, необходимая специфичн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.